煙稻輪作條件下有機肥施用時期對烤煙碳氮代謝的影響

高靜娟， 朱晨宇， 柯玉琴， 鄭朝元， 李春英， 李文卿*

（1.福建農林大學資源與環境學院國際鎂營養研究所，福州 350002； 2.福建農林大學生命科學學院，福州 350002； 3.福建省煙草專賣局煙草科學研究所，福州 350013）

碳氮代謝是烤煙最基本的代謝過程，在植物生長發育中起著關鍵作用[1]，與煙葉品質形成密切相關[2]。在煙葉生長發育和成熟過程中，只有碳氮代謝平衡協調，才能生產出優質煙葉。煙株葉綠體色素含量、光合特性、熒光特性以及碳氮代謝關鍵酶活性是衡量碳氮代謝過程是否平衡的關鍵指標，研究碳氮代謝對煙葉品質形成的影響有重要意義。

烤煙碳氮代謝過程在很大程度上受到施肥處理的影響[3]，碳氮代謝平衡與施肥的種類、用量等密切相關[4-5]。吳飛躍等[6]研究表明，有機肥的施用能增強總糖、總氮積累能力，降低煙堿含量，對中部葉碳氮代謝影響較大；王樹會等[7]研究表明，增施草炭可以在一定程度上促進煙株生長，提高煙葉產量、降低煙葉淀粉含量、改善煙葉品質，且與草炭用量呈負相關；王林虹等[8]研究表明生物炭可以改善煙葉品質；肖艷松等[9]發現，增施有機肥能促進煙葉生長發育，延長大田生育期，提高中、上部葉耐熟性，改善煙葉化學成分的協調性，提高上等煙比例，從而提高煙葉產值。

大量的化肥施用已不能有效地提高煙葉品質[10]，且存在肥料浪費和一定的環境問題[11]。近年來，福建烤煙生產中較為重視稻草回田和有機肥施用，可起到改善土壤微生物群落結構[12-13]、提高土壤質量的作用[14]。福建煙區為煙-稻輪作模式，生產中一般只關注烤煙當季施肥對烤煙生產的影響，水稻季施肥對烤煙生產影響的相關研究未見報道。另外，南方春煙區烤煙生長后期常遇高溫和強光天氣而導致煙葉高溫逼熟，影響煙葉烘烤特性，對上部葉烘烤質量產生較大負面影響。鑒于此，本研究通過2 年定位試驗，研究了烤煙季和水稻季分別施用餅肥對烤煙生長生理特性的影響，旨在為煙稻輪作區養分管理和烤煙生長后期煙葉養熟管理措施的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

烤煙品種為福建省主栽品種‘翠碧一號’（CB-1），種子為包衣種子，由三明市煙草公司提供。試驗所用化肥和餅肥均由三明金明農資有限公司提供。

1.2 試驗方法

試驗在福建省煙草科學研究所福州宦溪科研基地進行。試驗于2017 年烤煙采收結束后水稻季開始，2019 年烤煙生產季測定烤煙生理指標。2017年晚稻收割后，按梅花5點取耕作層（約0—20 cm）土樣，過1 cm 篩后，混合均勻，四分法留1.5 kg 樣品，風干，測定其養分含量；2018 年水稻收割后，每小區按照相同方法取樣，測定土壤養分含量。2017 年基礎土壤和2019 年栽煙前土壤養分狀況見表1。

表1 試驗田土壤肥力狀況Table 1 Status of soil fertility in test plot

試驗設計4個施肥處理。①烤煙季，純化肥施用，施氮量為97.5 kg·hm-2；水稻季，純化肥施用，施純氮126 kg·hm-（2T1處理）。②烤煙季，化肥+餅肥處理，化肥氮施用為97.5 kg·hm-2，移栽時施用5 625 kg·hm-2餅肥；水稻季，純化肥施用，施純氮126 kg·hm-（2T2處理）。③烤煙季，純化肥施用，施氮量為97.5 kg·hm-2；水稻季，化肥+餅肥處理，施化肥純氮126 kg·hm-2，移栽時施用5 625 kg·hm-2餅肥（T3 處理）。④烤煙季，化肥+餅肥處理，施化肥氮量為97.5 kg·hm-2，移栽時施用5 625 kg·hm-2餅肥；水稻季，化肥+餅肥處理，施化肥純氮126 kg·hm-2，移栽時施用375 kg·hm-2餅肥（T4處理）。

各小區面積266.67 m2，不設重復。烤煙季施用化肥氮97.5 kg·hm-2，N∶P2O5∶K2O均為1∶0.8∶2.8；水稻季施用化肥氮126 kg·hm-2，N∶P2O5∶K2O 均為1∶0.59∶0.27；餅肥N、P2O5和K2O 含量分別為6.45%、2.70%和1.71%。在每年晚稻收割后將所有稻草粉碎后均勻撒回田間，灌水溶田，移栽前1 個月左右排水，曬干后起壟。烤煙肥料種類為專用肥、餅肥、鈣鎂磷肥和復合肥；水稻季肥料種類為碳銨、餅肥、過磷酸鈣、尿素和復合肥。煙株于1 月25 日移栽，4 月5 日團棵，5 月16 日開始采收。田間管理同目前生產上優質煙生產方法。

1.3 測定方法

2019年6月11日對烤煙上2棚葉采收時進行取樣，每處理取4 株煙株的倒2、倒3 葉片帶回實驗室，剔除主脈并剪碎混勻后，測定各生理指標。

1.3.1 葉綠體色素測定 采用Arnon 法[15]測定葉綠體色素含量：稱葉圓片0.15 g置于25 mL容量瓶中，用80%丙酮定容，置于暗處浸提24～48 h，其間振蕩數次，待葉片完全發白、色素全部溶于丙酮溶液后，用UV-2601紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）分別測定470、646 和663 nm 處的OD 值，計算葉綠素a（chlorophyll a）、葉綠素b(chlorophyll b)、總葉綠素（chlorophyll）和類胡蘿卜素（carotenoids）的含量，重復3次取平均值。

1.3.2 光合參數測定 在取樣前用CIRAS-Ⅱ型（英國PP-system 公司）便攜式光合儀測定光合參數。儀器葉室類型為直徑18 mm 的圓形葉室，測定葉面積2.5 cm2，葉室溫度為25 ℃，設定LED 內置光照強度1 000 μmol·m-2·s-1，大氣環境作為CO2源。設置好參數后用葉室探頭夾住煙株最上部完全展開葉進行測定，指標包括凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、氣孔導度(stomatal conductance，Gs)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr) 和胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)，待測定指標數據穩定后進行數據保存，每組重復測定5株葉片，計算平均值。

1.3.3 熒光參數測定 采用熒光儀（Pocket PEA,Hansatech,英國）測定，利用暗適應夾暗處理待測葉片30 min，將暗適應夾連接上光合儀探頭進行測定，每組重復測定5株葉片，計算平均值。

初始熒光（initial fluorescence，Fo）表示PSⅡ反應中心全部開放時即原初電子受體全部氧化時的熒光水平，理論上用來指反應中心未能發生光化學反應時的葉綠素熒光。可變熒光（variable fluorescence，Fv）反映可參與PSⅡ光化學反應的光能輻射部分，黑暗中最大可變熒光強度反映了輔酶A的還原情況。最大熒光（maximal fluorescent，Fm），是已經暗適應的光合機構全部PSⅡ中心都關閉時的熒光強度，這時所有的非光化學過程都最小，這是標準的最大熒光，可反映PSⅡ電子傳遞情況，Fm=Fv+Fo。 最大光化學效率（maximum photochemical efficiency，Fv/Fm）代表PSⅡ光化學的最大效率或PSⅡ原初光能轉化效率，常與光抑制程度相關，在正常條件下，該值范圍在0.80～0.84，該值越高，反映植物受到光抑制的程度越低。Fv/Fo反映潛在光化學活性（potential photochemical efficiency）的高低，常用來度量PSⅡ的潛在光化學效率，常用于度量PSⅡ的潛在活性。

1.3.4 酶活性測定 采用上海通蔚實業有限公司研發的植物二磷酸核酮糖羧化酶（Ribulose bisphosphate carboxylase，RuBPCase）酶聯免疫分析(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒測定，以每毫克蛋白中二磷酸核酮糖羧化酶含量(ng)定義為1 個酶活力單位（1U）。硝酸還原酶（nitrate reductase, NR）的活性參照鄒琦[15]的方法測定，以每克植物鮮重每小時產生亞硝態氮量(μg)為1 個酶活力單位（1U）。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性參照鄒琦[15]的方法測定，以每毫克蛋白每小時在540 nm 處消光值變化1 定義為1 個酶活力單位（1U）。蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）和蔗糖合成酶（sucrose synthetase，SS）活性測定參照趙越等[16]方法，以每毫克蛋白每分鐘產生蔗糖量(μg)為1個酶活力單位（1U）。

1.4 數據分析

利用SPSS 軟件進行數據的統計分析，以Duncan’s 法比較不同處理間差異顯著性，利用Excel軟件進行平均值的計算及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對煙株生長的影響

從圖1 可見，T1 處理長勢最弱，株型較小，且煙株葉片嚴重發黃，表現脫肥。T3 處理煙株長勢略好于T1處理，但明顯弱于T2和T4處理，株型相對較小，這可能是由于水稻季施用的有機肥殘留為煙株提供了一定的養分。T2 和T4 處理煙株長勢都較好，沒有明顯的差異，這可能是烤煙當季增施有機肥可以更好地滿足煙株的生長發育。

圖1 不同處理下煙株長勢Fig. 1 Plant growth of tobacco under different treatments

2.2 不同處理對煙株葉綠體色素含量的影響

從表2 可見，不同處理葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量變化規律一致，均表現為T4＞T2＞T3＞T1。其中，煙稻2 季均為化肥和有機肥配施處理（T4 處理）的煙株葉綠素a、總葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著高于其他處理，葉綠素b 含量T4 與T2 處理差異不顯著，但顯著高于T1和T3 處理，后兩者之間葉綠素b 含量差異不顯著；T2 和T3 處理的總葉綠素含量和葉綠素a 含量差異不顯著，但均顯著高于純施化肥的T1 處理；類胡蘿卜素含量在4 個處理間均表現為顯著差異。雖然烤煙季施肥T1 處理和T3 處理一樣，T2處理和T4處理一樣，但各葉綠體色素含量卻均表現為T3＞T1、T4＞T2，說明T3、T4 處理水稻季施用有機肥可以促進煙株葉綠體色素含量提高，即水稻季施用有機肥的肥效可持續到烤煙季。而T2和T3處理一年中有機肥施用量相同，但類胡蘿卜素含量卻表現為T2＞T3，說明其有機肥肥效主要在當季釋放。

表2 不同處理下煙株葉綠體色素含量Table 2 Chloroplast pigment content of tobacco plant under different treatments

2.3 不同處理對煙株光合特性的影響

從表3 可見，烤煙的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)均在T4 處理時最大，T1 處理時最小，整體表現為T4＞T2、T3＞T1；而胞間CO2濃度(Ci)為T4 處理時最小，T1 處理時最大。凈光合速率(Pn)和氣孔導度(Gs)均表現為T2＞T3，表明有機肥施用在烤煙季能更有效地促進烤煙光合作用。由此可見，當季有機肥的施用能有效增強烤煙凈光合速率(Pn)和氣孔導度(Gs)，從而在一定程度上增強葉片的光合作用，增加烤煙干物質的積累。

表3 不同處理下煙株光合特性Table 3 Photosynthetic characteristics of tobacco plant under different treatments

2.4 不同處理對煙株熒光特性的影響

由表4 可知，T3 處理的初始熒光（Fo）最高，顯著高于T1和T2處理；T4處理最大熒光（Fm）最高，顯著高于T1 和T2 處理，且T2 處理顯著高于T1處理；各處理可變熒光（Fv）由大到小依次為T4＞T2＞T3＞T1，且T4 處理顯著高于T1 處理，說明T4 處理煙株葉片PS Ⅱ活性最大。最大光化學效率（Fv/Fm）表現為T1 處理顯著低于其他處理，表明T1 處理的抗逆性較弱； T4 處理PSⅡ潛在光化學效率（Fv/Fo）最大且顯著高于T1、T2 處理，表明T4處理對環境有更強的適應性。

表4 不同處理下煙株葉綠素熒光參數Table 4 Fluorescence characteristics of tobacco plant under different treatments

2.5 不同處理對煙株核酮糖二磷酸羧化酶活性的影響

從圖2 可見，T4 處理二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPCase）活性最高，顯著高于T1 處理，T2、T3處理RuBPCase 活性高于T1 處理，但二者差異不顯著。說明煙稻2 季均化肥和有機肥配施能更好地提高烤煙RuBPCase活性，僅水稻季配施有機肥能在一定程度上提高第2 年烤煙RuBPCase 活性，但沒有僅烤煙季施用有機肥提高效果明顯。

圖2 不同處理下采收期烤煙RuBPCase的活性Fig. 2 RuBPCase activity of flue-cured tobacco during harvest under different treatments

2.6 不同處理對煙株硝酸還原酶活性的影響

從圖3 可見，不同施肥處理采收期烤煙硝酸還原酶（NR）活性由大到小依次為T4＞T2＞T3＞T1，其中，T4 處理顯著大于其他3 個處理，T1 處理顯著小于其他3 個處理，T2 和T3 處理差異不顯著。煙稻2 季均化肥和有機肥配施處理的煙株葉片NR 活性顯著高于其他施肥處理，煙稻2 季僅施用化肥處理的煙株葉片NR 活性顯著低于其他處理，表明配施有機肥提高了煙株NR 活性，促進了煙株后期氮代謝過程。

2.7 不同處理對煙株谷氨酰胺合成酶活性的影響

從圖4 可見，不同處理采收期烤煙谷氨酰胺合成酶（GS）活性由大到小依次為T2＞T4＞T3＞T1，T2 處理GS 活性顯著高于其他3 個處理，T1、T3、T4 處理間差異不顯著，說明配施一定量有機肥能提高煙株對氨的同化及氮素的利用。T4 處理GS 活性顯著低于T2 處理，可能是由于T4 處理配施有機肥量較多，在一定程度上抑制了GS活性。

圖4 不同處理下采收期烤煙GS活性Fig. 4 GS activity of flue-cured tobacco during harvest under different treatments

2.8 不同處理對煙株蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性的影響

從圖5 可以看出，不同處理采收期烤煙蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性由大到小依次為T4＞T2＞T3＞T1，T4處理SPS活性顯著高于其他3個處理，T1處理SPS活性顯著低于其他3個處理，T2、T3處理間差異不顯著。蔗糖合成酶（SS）活性由大到小依次為T2＞T4＞T3＞T1，T2、T4 處理間差異不顯著，但都顯著高于T1、T3處理，且T3處理SS活性顯著高于T1 處理。說明配施有機肥能顯著提高烤煙葉片光合產物轉化為蔗糖的能力，且僅烤煙季配施比僅水稻季配施提高效果更明顯，煙稻2 季均化肥和有機肥配施提高效果最好。

圖5 不同處理下煙株SPS和SS活性Fig. 5 Activities of SPS and SS in tobacco plant under different treatments

3 討論

有機肥有助于改善煙葉外觀質量、協調煙葉化學成分[17]。本研究表明，有機肥配施能夠提高煙葉葉綠體色素含量，提高光合電子傳遞，促進光合作用，提高碳氮代謝關鍵酶活力。T2和T3處理在1 年中有機肥施用量相同，但類胡蘿卜素含量卻為T2＞T3，說明有機肥肥效主要在當季釋放。當烤煙季施肥相同時，葉綠體色素含量卻為T3＞T1、T4＞T2，這主要是由于T3、T4 處理水稻季施用了有機肥，有機肥肥效的釋放過程緩慢，除了被水稻利用外，肥效可持續到烤煙季。本研究中，配施有機肥處理的煙株總葉綠素含量均高于僅化肥施用的煙株，這與宋玉川等[18]研究結果一致。所有處理的Fv/Fm均在0.53～0.85 之間，說明試驗煙株PSⅡ功能完整，但T4處理的最大熒光（Fm）和可變熒光（Fv）均最大，說明T4 處理煙株PSⅡ活性最高，且T4 處理Fv/Fo最大，反映了PSⅡ對激發能量的使用效率最高，能量耗散少。此結果與T4處理的凈光合速率（Pn）最大一致。本研究中T4 處理的凈光合速率（Pn）最大，而凈光合速率（Pn）高的處理氣孔導度（Gs）高，胞間CO2濃度(Ci)卻低；說明不同施肥處理的光合作用受到非氣孔因素的影響，可能是由于葉綠素含量的差異和光合電子傳遞效率的差異共同導致的。常浩杰等[19]在番茄幼苗中的研究也表明增施不同生物有機肥對光合速率均有促進作用。曾祥難等[20]研究表明，合理配施復合有機肥在一定程度上有利于促進烤煙生長的光合速率，并在生長后期仍能保持一定的生理代謝強度，持續地促進光合產物合成。

與煙稻季均僅施用化肥相比，配施有機肥提高了煙葉RUBPCase、NR、GS、SPS 和SS 活性。本研究結果顯示，煙稻2 季均施用有機肥處理的煙株RUBPCase 活性高于其他處理，促進其碳的同化代謝過程，與楊凱等[21]研究結果相同。煙稻季都施用有機肥的煙株SPS活性顯著高于其他施肥處理，促進光合作用產物向蔗糖的轉化。張玉平等[22]研究結果也同樣顯示，有機無機肥配施有利于改善春玉米光合特性，提高玉米功能葉蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性。配施有機肥處理，煙株SS活性顯著高于純化肥處理，表明有機肥的施用促進了蔗糖的分解，提高了煙株內碳代謝水平。本研究結果顯示，煙稻2 季均配施有機肥能顯著提高煙株的NR 活性，這可能是由于有機肥的配施除提供碳源外，還在一定程度上增加氮源，在提高煙株碳代謝過程中協同促進煙株氮代謝過程。宋玉川等[18]研究結果表明，配施有機肥的處理煙葉NR活性高于單施無機肥的煙葉，與本研究結果相同。T2 處理GS 活性顯著高于其他3 個處理，且T1、T3、T4 處理間差異不顯著，這可能是由于T4處理有機肥的施用量過多，在一定程度上抑制了GS 活性。楊凱等[21]研究表明熏蒸和有機替代均提高了西瓜果實氮代謝關鍵酶（NR、NiR、GS、GOGAT）的活性，與本研究結果相似。

目前烤煙生產中較為重視烤煙季有機肥的施用，從本研究結果看，水稻季施用餅肥對烤煙生長仍有較明顯的影響。因此，土壤質量的提升和烤煙生產的可持續發展是個綜合過程，應綜合考慮烤煙和水稻2 季的施肥措施改進。與煙稻季僅施用化肥相比，有機肥的配施提高了煙株葉綠體色素含量、光合電子傳遞效率進而促進煙葉光合作用，協調了碳氮代謝過程，以煙稻2 季均化肥有機肥配施處理的提高作用最明顯。總體來看，僅1季化肥有機肥配施時，施用在烤煙季的促進效果更好。與其他處理相比，煙稻2 季均化肥有機肥配施更能滿足煙株對養分的需求，不僅能顯著的提高光合作用，更能夠促進光合產物的轉化以及氮代謝水平，從而保證了煙株體內各種代謝過程的順利進行，有利于煙葉在田間養熟和優質煙葉的品質形成。