銀屑病中濾泡性輔助性T細胞及IL-21對HaCaT細胞增殖及細胞周期的影響

李思彤 王傲 白彥萍 王英

1北京協和醫學院研究生院 （北京 100029）；2中日友好醫院皮膚科 （北京 100029）

銀屑病（psoriasis）是一種常見的慢性炎癥性疾病，全球發病率約2% ～ 3%，除了有皮膚損害外，還可引起代謝綜合征、糖尿病、靜脈血栓栓塞、抑郁癥等其他共病，嚴重影響著患者的身心健康及生存質量［1-4］。銀屑病病因復雜，具體發病機制不明，其發病的中心環節是T 細胞及其細胞因子介導的免疫功能異常，尤其是CD4+T 淋巴細胞亞群功能失調在銀屑病發生發展中起到重要作用［5］。目前發現的CD4+T 淋巴細胞亞群包含1 型輔助性T（type 1 T helper，Th1）細胞、Th2 細胞、Th17 細胞、調節性T 細胞、Th22 細胞、Th9 細胞及濾泡性輔助性T 細胞（T follicular helper cells，Tfh cells）。多項研究［6-10］已經顯示，不同的CD4+T 淋巴細胞亞群均不同程度地參與銀屑病的發生發展。但Tfh 細胞在銀屑病發病機制中研究尚少，具體作用機制也尚不明確。

Tfh 細胞最初發現于淋巴生發中心，外周血中也同樣存在。其重要特征是高表達趨化因子受體CXCR5，還可表達bcl-6、ICOS、PD-1 等多種細胞因子［11］。本課題組前期發現，尋常型銀屑病患者外周血Tfh 細胞頻率明顯升高，且與疾病嚴重程度呈正相關［12-13］。IL-21 是Tfh 細胞的主要功能性分子，其受體在淋巴細胞及角質形成細胞上均有表達［14］。銀屑病患者外周血中IL-21 表達較健康人明顯增加［15］。在銀屑病小鼠模型中，IL-21 可促進角質形成細胞增殖，與小鼠銀屑病皮損嚴重程度呈正相關。以上研究均提示Tfh 細胞及IL-21 在銀屑病發病中可能起到重要作用。本研究擬探究體外條件下尋常型銀屑病患者外周血中Tfh 細胞及其主要功能性細胞因子IL-21 對角質形成細胞的影響，進一步明確Tfh 細胞在銀屑病發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 銀屑病組：選取15 例就診于中日友好醫院皮膚科的尋常型銀屑病患者，年齡18 ～ 62歲，平均（38.87 ± 13.64）歲，其中男10例，女5 例。所有患者近3 個月內不曾局部外用皮質類固醇激素及鈣調磷酸酶抑制劑，近6 個月內不曾系統應用糖皮質激素、免疫抑制劑、生物制劑及光療；未合并其他免疫性疾病、腫瘤或感染性疾病等。簽署知情同意書后，采集患者臨床信息并使用肝素鈉抗凝管抽取早晨空腹外周血20 mL。對照組：選取10 名健康志愿者采集早晨空腹外周血20 mL，其性別、年齡與銀屑病組匹配，均無銀屑病家族史且未合并其他免疫性疾病、腫瘤或感染性疾病等。

1.1.2 細胞來源 HaCaT 細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

1.1.3 主要試劑和儀器 人淋巴細胞分離液、高爾基體阻斷劑、紅細胞裂解液、Falcon、Ki67 APC購自美國BD Bioscience 公司，Foxp3 轉錄因子染色試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone 公司，青霉素/鏈霉素溶液、DMEM 培養基購自美國Gibco 公司，CXCR5 Alexa Fluor 647、CD4 FITC 及IL-21 重組蛋白購自美國Abcam 公司，Anti-human IL-21-mAbs 購自瑞典Mabtech公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學。超凈工作臺為北京半導體設備廠產品，生物安全柜、臺式低溫離心機為美國Thermo Fisher Scientific公司產品，FACS Araill流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 HaCaT 細胞傳代培養及準備 HaCaT 細胞復蘇后，用含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養基置于37 ℃的CO2培養箱中，待細胞生長至80%融合強度時，按照1∶3 比例進行傳代培養。隨后取對數生長期的HaCaT 細胞，以1 × 105個/孔種于12 孔板中，用于檢測細胞周期及Ki-67；以1 × 104個/孔種于96 孔板中，用于CCK-8 檢測HaCaT 細胞增殖。

1.2.2 流式細胞儀分選Tfh 細胞 Ficoll-Hypaque密度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）后，使用PBS 溶液重懸PBMC，混勻后吸取到流式試管中，加入抗人CD4 和CXCR5 流式抗體，混勻后室溫避光染色30 min。每管加入3 mL 的PBS 溶液，混勻，1 600 r/min，離心6 min 棄上清液。再次加入PBS 溶液洗滌1 次，1 600 r/min，離心6 min 棄上清液，加入4.5 mL PBS 溶液放在冰上保存，上機檢測，圈出CD4+CXCR5+的Tfh 細胞。

1.2.3 細胞分組處理

1.2.3.1 HaCaT 細胞與IL-21 組 將HaCaT 細胞隨機分為IL-21 刺激組（加入10 ng/mL 的IL-21 蛋白）和空白對照組（以相同體積含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 高糖培養基代替IL-21 蛋白），置于37 ℃的CO2培養箱共培養72 h 后，用0.125%胰蛋白酶消化5 min，收獲HaCaT 細胞懸液。

1.2.3.2 HaCaT 細胞與Tfh 細胞共培養組 共培養前使用1 μg/mL 的CD3 抗體活化Tfh 細胞，在HaCaT 細胞培養孔中按照1∶1 的比例分別加入正常人和銀屑病患者的Tfh 細胞懸液。本組又分為IL-21 刺激組（加入10 ng/mL 的IL-21 蛋白），中和抗體組（加入1 μg/mL 的Anti-IL-21 中和抗體）以及單純共培養組（加入等體積培養基）。共培養72 h后，輕輕吹打除去未貼壁的Tfh 細胞，貼壁的HaCaT細胞用0.125%胰蛋白酶消化5 min，收獲HaCaT 細胞懸液。

1.2.4 流式細胞技術檢測HaCaT 細胞Ki-67 表達 將上述HaCaT 細胞取出用PBS 重懸，調整每管為2 × 104細胞。使用Foxp3 轉錄因子染色試劑盒按照說明書方法進行破膜，加入Ki-67 抗體避光孵育，預備上機檢測。

1.2.5 CCK-8 法檢測HaCaT 細胞增殖活性 設定4 個復孔，按照1.2.3 分組處理后共培養72 h，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，37 ℃條件下孵育2 h。測定450 nm 波長處各孔的吸光度（OD）值。

1.2.6 流式細胞技術測定HaCaT 細胞周期 將培養結束后獲取的HaCaT 細胞離心，1 500 r/min，5 min。棄去上清收集細胞并計數。用預冷的1 mL PBS 洗滌兩次，每管加入3 mL 70%預冷乙醇，在-20 ℃冰箱固定6 h后離心棄去上清液。用預冷PBS再次洗滌去乙醇。每管中加入濃度為100 μg/mL的RNase A 酶，放入37 ℃的水浴箱溫浴30 min。取出后用PBS 洗滌，棄去上清液，每管中加入500 μL溴化乙錠（PI）避光孵育30 min，上機檢測。

1.3 統計學方法 所有數據均用SPSS 26.0 統計軟件及Graphpad Prism 8.0 進行統計分析及繪圖，兩組間數據比較使用Mann-Whitney 秩和檢驗，使用Spearman 秩相關性分析。檢驗水準取α=0.05，P＜ 0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-21 可促進HaCaT 細胞增殖 CCK-8 法顯示，加入IL-21 后HaCaT 細胞的增殖活性明顯高于空白對照組（P＜ 0.000 1）。與空白對照組比較，IL-21 使HaCaT 細胞S 期細胞比例升高，G0/G1期細胞比例下降，增殖指數PI 升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。但流式細胞術檢測結果提示加入IL-21 未明顯促進HaCaT 細胞中Ki-67 的表達（P＞0.05）。見表1 及圖1、2。

圖1 IL-21 對HaCaT 增殖活性及細胞周期的影響Fig.1 Effects of IL-21 on proliferation and cell cycle of HaCaT cells

圖2 IL-21 對HaCaT 細胞Ki-67 表達的影響Fig.2 Effectsof IL-21 on expression of Ki-67 of HaCaT cells

表1 IL-21 對HaCaT 細胞周期的影響Tab.1 Effects of IL-21 on cell cycle of HaCaT cells±s，%

表1 IL-21 對HaCaT 細胞周期的影響Tab.1 Effects of IL-21 on cell cycle of HaCaT cells±s，%

注：PI，增殖指數，PI=（S期+G2M期）/（S期+G0G1期+G2M期）×100%，可表示HaCaT細胞增殖

分組細胞周期S PI HaCaT IL-21+HaCaT P值G0/G1 57.81 ± 10.51 47.01 ± 9.02＜ 0.05 42.19 ± 10.51 52.99 ± 9.01＜ 0.05 32.85 ± 8.56 43.73 ± 8.37＜ 0.05 G2/M 9.34 ± 3.71 9.26 ± 2.90＞ 0.05

2.2 Tfh 細胞與HaCaT 細胞共培養

2.2.1 Tfh 細胞可促進HaCaT 細胞增殖 CCK-8法顯示，與Tfh 細胞共培養時HaCaT 細胞增殖活性明顯升高（P＜ 0.000 1），銀屑病組較健康對照組更能促進HaCaT 細胞增殖（P＜ 0.05）；流式細胞術顯示銀屑病組Ki-67 有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖3。

圖3 Tfh 細胞對HaCaT 細胞增殖活性和Ki-67 表達的影響Fig.3 Effectsof Tfhcellson proliferation and expressionof Ki-67 of HaCaT cells

2.2.2 阻斷IL-21 可降低Tfh 細胞對HaCaT 細胞增殖的促進作用 IL-21 刺激組中HaCaT 細胞增殖活性及Ki-67 的表達均較IL-21 中和抗體組高。在銀屑病組中，中和IL-21 使HaCaT 細胞增殖活性及Ki-67 的表達明顯降低（P＜ 0.05），健康對照組則未見此抑制作用。見表2 及圖4。

圖4 IL-21 對Tfh 細胞共培養組中HaCaT 細胞增殖活性及Ki-67 的影響Fig.4 Effects of IL-21 and Tfh cells on proliferation and expression of Ki-67 of HaCaT cells

表2 IL-21 對Tfh+HaCaT 細胞共培養組中HaCaT 細胞增殖活性及Ki-67 的影響Tab.2 Effects of IL-21 and Tfh cells on proliferation and expression of Ki-67 of HaCaT cells±s

表2 IL-21 對Tfh+HaCaT 細胞共培養組中HaCaT 細胞增殖活性及Ki-67 的影響Tab.2 Effects of IL-21 and Tfh cells on proliferation and expression of Ki-67 of HaCaT cells±s

分組Ki-67（%）細胞增殖活性（od450）HC 2.49 ± 0.94 3.04 ± 0.73 2.46 ± 0.58 Tfh+HaCaT IL-21 IL-21中和抗體PV 3.42 ± 0.94 3.57 ± 0.69 2.47 ± 0.96 HC 53.80 ± 22.48 68.61 ± 17.78 48.45 ± 20.61 PV 64.29 ± 10.45 61.28 ± 22.01 42.13 ± 18.92

2.2.3 Tfh 細胞及IL-21 對HaCaT 細胞周期的影響 Tfh-HaCaT 細胞單純共培養時，銀屑病組較健康對照組G0/G1期縮短、PI 升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。IL-21 刺激時，銀屑病組及健康對照組的HaCaT 細胞均較中和抗體組G0/G1期比例降低、PI升高，其差異有統計學意義（P＜ 0.05）。阻斷IL-21 使HaCaT 細胞S 期細胞比例降低、G0/G1期細胞比例升高、PI降低，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。見表3 及圖5。

圖5 Tfh 細胞及IL-21 對HaCaT 細胞周期的影響Fig.5 Effects of Tfhcells and IL-21 on cell cycle of HaCaT cells

表3 Tfh 細胞及IL-21 對HaCaT 細胞周期的影響Tab.3 Effects of Tfh cells and IL-21 on cell cycle of HaCaT cells±s

表3 Tfh 細胞及IL-21 對HaCaT 細胞周期的影響Tab.3 Effects of Tfh cells and IL-21 on cell cycle of HaCaT cells±s

注：HC：健康對照組；PV：銀屑病組；T+H：Tfh細胞與HaCaT細胞共培養組；T+H+I：向Tfh細胞與HaCaT細胞共培養組加入IL-21；T+H+A：向Tfh細胞與HaCaT細胞共培養組加入IL-21中和抗體

分組細胞周期（%）S PI 45.68 ± 10.18 52.87 ± 9.86 41.01 ± 9.62 53.82 ± 6.03 50.04 ± 6.46 43.07 ± 8.91 HC-T+H HC-T+H+I HC-T+H+A PV-T+H PV-T+H+I PV-T+H+A G0/G1 54.33 ± 10.18 47.13 ± 9.86 58.98 ± 9.62 46.18 ± 6.03 49.96 ± 6.46 56.93 ± 8.91 37.11 ± 10.79 41.77 ± 7.62 33.06 ± 9.77 43.86 ± 9.00 39.50 ± 6.91 33.54 ± 8.19 G2/M 8.57 ± 3.86 11.10 ± 3.13 7.95 ± 2.58 9.96 ± 4.48 10.55 ± 3.43 9.53 ± 2.31

3 討論

Tfh 細胞是一種CD4+輔助性T 細胞，在傳染性疾病、自身免疫疾病如系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、癌癥等疾病中均有一定作用，是連接細胞免疫與體液免疫的橋梁［16-17］。Tfh 細胞高表達CXCR5，還可表達ICOS、PD-1 以及BCL-6 等，為B 細胞成熟和生成抗體提供輔助功能［18-19］。結合文獻和課題組前期研究，在尋常型銀屑病患者外周血中CD4+CXCR5+的Tfh 細胞數量較健康人明顯增多且處于活化狀態，與銀屑病嚴重程度呈正相關［11，13］。銀屑病患者皮損中浸潤的Tfh 細胞數量也較非皮損部位明顯增加［12］。IL-21是活化CD4+T 細胞的標志，也是Tfh 細胞的主要功能性分子，由Tfh 細胞、Th17 細胞以及NK 細胞產生，具有多種功能，可影響多種免疫細胞和非免疫細胞［9］。IL-21 可調節其他免疫細胞的發育、增殖和功能，如IL-21 可影響T 細胞和B 細胞的分化增殖，誘導幼稚B 細胞和記憶B 細胞分化為漿細胞［9］；還可誘導成熟CD8+T 細胞以及NK 細胞，并增強其細胞毒性［11］。此外，IL-21 還可抑制樹突狀細胞的抗原提呈功能，并可促進B 細胞和NK 細胞的凋亡。許多研究［12-14］表明IL-21 在自身免疫性疾病、炎性疾病和腫瘤中起重要作用，而銀屑病患者中IL-21 表達也較健康對照明顯增多［15］。Tfh 細胞是IL-21 的主要來源，而IL-21 又可對Tfh 細胞的初始發育進行刺激［16］。因此，本研究以IL-21 為切入點，在體外條件下探究尋常型銀屑病中Tfh 細胞對HaCaT 細胞的影響。

在本實驗中，首先探究了IL-21 在體外條件下對HaCaT 細胞的影響。CCK-8 法提示加入IL-21后HaCaT 細胞在450 nm 波長處吸光度值增強，流式細胞術檢測細胞周期則提示IL-21 刺激組S 期細胞比例升高，G0/G1期細胞比例下降，說明IL-21在體外可促進HaCaT 細胞增殖活化，而銀屑病的典型病理特征之一即棘層肥厚，由此推斷IL-21 有可能是銀屑病的致病因子之一。使用流式細胞術檢測IL-21 刺激后HaCaT 細胞Ki-67 的表達未見明顯增強，與另外兩種實驗方法得出的結論不甚一致，推測是由于Ki-67 的表達屬于半定量統計且樣本量較小，可能存在一定的統計學偏差，后續實驗可進一步擴大樣本量或使用細胞免疫組化統計Ki-67 的表達。當與Tfh 細胞共培養時，無論銀屑病組與健康對照組，HaCaT 細胞增殖活性均提高，銀屑病組的促進作用更強；在銀屑病組中，IL-21中和抗體組與Tfh+HaCaT 單純共培養組比較，可將 HaCaT 細胞阻滯于 G0/G1期，減少 S 期細胞數量，進而抑制Tfh 細胞對HaCaT 細胞增殖的促進作用。由此推測Tfh 細胞可能通過IL-21 引起角質形成細胞過度增殖，從而促進銀屑病的發生。

綜上，本研究首次探討銀屑病患者外周血Tfh細胞在體外條件下對HaCaT 細胞的影響，在細胞水平進一步探討了銀屑病可能的發病機制，闡述了Tfh 細胞及其主要功能分子IL-21 在銀屑病發生發展中的可能作用。但IL-21 能否成為銀屑病免疫治療的新靶點，尚需進一步研究。

【Author contributions】LI Sitong performed the experiments and wrote the article.WANG Ao and BAI Yanping revised the article.WANG Ying designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.