我國水稻白葉枯病和條斑病發生與防控研究進展

徐夏萌, 沈麗麗, 閆佳麗, 王 勇, 徐正銀, 陳功友*

(1. 上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；2. 光明食品集團上海川東農場有限公司種植業中心，鹽城 224133)

水稻是中國第一大糧食作物,其產量占中國糧食產量的40%左右。由稻黃單胞菌稻致病變種Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)引起的水稻白葉枯病(bacterial leaf blight,BLB)是水稻三大病害(稻瘟病、白葉枯病和稻紋枯病)之一,由稻黃單胞菌稻生致病變種Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xoc)引起的水稻細菌性條斑病(bacterial leaf streak,BLS)已發展成為水稻的第四大病害。水稻細菌性條斑病應簡稱為條斑病,不應簡稱為細條病,因為我國植物病害的名稱是根據病害癥狀特點而命名的,即因受平行葉脈限制而形成的條形病斑是條斑病的典型特點。白葉枯病“老病重發”,條斑病“新病暴發”和兩種病害混合發生,成為我國南方水稻產區重要致災病害。常發年份水稻減產10%～30%,暴發年份減產50%以上。據統計,我國兩種致災病害重發年份發生面積200萬hm2左右,嚴重威脅我國糧食安全生產[1]。我國水稻受白葉枯病和條斑病危害的主要原因在于病害的綠色防控依然存在3個短板。1)病害成災機制不清楚:對我國水稻產區兩種病菌毒性組成的分子基礎不清楚,無法有效監控預警,也不能針對性地布局抗病品種;2)精準抗病育種新技術匱乏:現利用的抗病基因正不斷地被病菌克服抗性,缺乏科學預見和新的抗病育種技術;3)綠色農藥和防控技術短缺:田間病害發生時防控方法老套,缺乏綠色防控農藥。

1 兩種水稻細菌病害的差異

目前已經鑒定的白葉枯病抗病基因(R)約47個[1-2],而這些R基因絕大多數不抗條斑病;相應地,抗條斑病的R基因不抗白葉枯病。這主要與兩種水稻細菌病害的發生特點和病菌致病因子的差異有關。白葉枯病是系統性維管束侵染病害,而條斑病是局部性薄壁細胞侵染病害[3]。Xoo和Xoc雖均為稻黃單胞菌X.oryzae,但是兩個不同的致病變種(pathovar)。除都能通過傷口侵染水稻外,Xoo還能通過水孔侵染水稻,在維管束中繁殖擴展危害,造成白葉枯病害癥狀;而Xoc則還能通過氣孔侵染,在薄壁細胞間繁殖擴展危害,受平行葉脈的限制,造成水浸狀長條形病害癥狀。Xoo和Xoc的侵染途徑和引起的病害癥狀差異可能與它們從水稻上獲得營養的方式有關,例如Xoo主要獲取蔗糖等[4-6],而Xoc主要獲取硫化物等[7]。

2 稻黃單胞菌tal基因是毒性變異的主要決定因子

因稻黃單胞菌所致水稻細菌病害在生產上的重要性,其被認為是模式植物水稻上的模式病原菌[3]。稻黃單胞菌組學和致病因子揭示,Xoo和Xoc存在類似的致病性因子,例如相似的分泌系統[8]、群體感應系統[9]、第二信使c-di-GMP[10]等,而在效應蛋白上存在差異,例如Xoc缺少與抗病基因Xa21對應的PAMP分子RaxX[11],Xoo缺少蛋白水解酶活性[12]、缺少匹配抗病基因Rxo1的Ⅲ型效應子AvrRxo1[13]以及缺少與水稻氣孔免疫互作的Xop蛋白XopC2[14]和XopAP[15]。重要的是,它們均擁有數量比較多的tal(transcription activator-like)基因編碼的TALE(TAL effector)蛋白[16-17]。稻黃單胞菌產生的TALE蛋白,借助Ⅲ 型分泌系統分泌進入水稻細胞核與水稻中相應的R或S基因啟動子的特定DNA序列結合(TAL effector-binding element, 簡稱EBE),起轉錄因子作用,激活R或S基因表達,從而水稻表現抗病性或感病性[16-17]。稻黃單胞菌 TALE蛋白高度保守,N-端和C-端幾乎相同,不同的是由34個氨基酸構成的重復單元數量不同,每個重復單元的第12和13位氨基酸種類可變(repeat-variable diresidues,RVDs);這2個位點的氨基酸可識別1個堿基;RVDs的種類和數量不同,TALE識別水稻中相應基因啟動子中的EBE序列不同[18-19]。雖然根據TALE蛋白的RVD可以預測其結合的EBE序列,從而發現TALE蛋白作用的植物靶標基因[20],但至今稻黃單胞菌的許多TALE蛋白在水稻中的靶標基因并不清楚,還需要通過生物學試驗進行發掘。

遺傳學分析發現,稻黃單胞菌的TALE蛋白存在2種類型[21-22](圖1)。一類為典型結構的TALE蛋白(typical TALE,tTALE),TALE蛋白間的差異性主要在中央重復區(CRR)的重復單元數量上,例如Xoo菲律賓6號小種PXO99A的TALE蛋白PthXo1的CRR中重復單元數量為23.5個[6]。已知作用于水稻靶標基因的TALE蛋白其CRR中重復單元的數量不同(表1),最少的重復單元僅有1.5個[12]。一般認為,重復單元在8個以上才能保證TALE蛋白發揮正常的功能[12]。另一類為截短類型的干擾性TALE蛋白(interfering TALE,iTALE),與tTALE相比,iTALE蛋白N-端缺失58個氨基酸,C-端缺失部分核定位信號和酸性轉錄激活域[22]。

表1 稻黃單胞菌TALE蛋白與水稻R/S基因對應關系Table 1 Rice R/S genes targeted by TALEs of Xanthomonas oryzae

圖1 稻黃單胞菌TALE蛋白類型Fig.1 TALE proteins of Xanthomonas oryzae

稻黃單胞菌tal基因的發現以及TALE蛋白在病害中的作用,揭示了稻黃單胞菌tal基因是病菌毒性變異的主要決定因子。

3 稻黃單胞菌TALE蛋白調控水稻的抗(感)病性

現有證據表明,稻黃單胞菌TALE蛋白通過結合水稻中靶標基因啟動子的EBE序列,激活靶標基因表達。根據TALE蛋白在水稻中的靶標基因功能,TALE蛋白有以下4種功能:

3.1 主要毒性因子(major virulence factor),靶向水稻感病基因

目前發現,非洲Xoo菌株含有7～8個tal基因,而亞洲菌株多達18個左右。因白葉枯病菌主要從水稻中獲得蔗糖和果糖等營養,病菌TALE蛋白作用于水稻糖轉運蛋白編碼基因的啟動子上,利于病菌獲得營養。水稻糖轉運蛋白編碼基因主要是Clade Ⅲ家族的OsSWEET11a、OsSWEET13和OsSWEET14,分別被白葉枯病菌的PthXo1、PthXo2和PthXo3激活[5-6, 23],并且人工合成的TALE蛋白也可以激活OsSWEET12和OsSWEET15基因的表達[4](表1)。PthXo1僅在菲律賓6號小種PXO99A中發現;而靶向OsSWEET13的PthXo2有5個變異的版本,相應地,水稻中被PthXo2識別的EBE存在10個類型[24];靶向OsSWEET14的TALE蛋白,在亞洲菌株中為PthXo3和AvrXa7[25]。非洲栽培水稻的歷史不長,非洲菌株的TalF和TalC也可靶向OsSWEET14,但其結合的EBE不同于PthXo3[4, 26]。對OsSWEET11a、OsSWEET13和OsSWEET14基因的啟動子中被TALE蛋白識別的EBE同時進行基因編輯,所創制的水稻材料廣譜抗水稻白葉枯病[24-25]。

白葉枯病菌的TALE蛋白還靶向水稻轉錄因子,例如PthXo7靶向OsTFIIAγ1[27],PthXo6和TalBMAI1靶向OsTFX1[27],TalBMAI1靶向OsERF#123[28](表1)。需要強調的是,雖然這些轉錄因子是感病基因,但它們被TALE蛋白激活后轉錄調控的下游基因并不清楚。

水稻條斑病菌的tal基因數量多達24～33個[16, 29]。可能條斑病菌對營養的需求不同于白葉枯病菌,靶向水稻感病基因的TALE蛋白目前已知的有2個:一是Tal2g和Tal5d,都靶向硫化物轉運蛋白編碼基因OsSULRT3;6[7, 30];另一是Tal2b和Tal2c,靶向2-酮戊二酸依賴型氧化酶基因OsF3H03g和OsF3H04g[31-32]。通過基因編輯技術突變OsSULRT3;6和OsF3H03g基因啟動子的EBE位點,均提高了水稻對條斑病的抗性[30-31, 33]。目前還沒有發現誘捕水稻條斑病菌TALE蛋白的R基因,不過有意思的是在非寄主煙草中存在誘捕AvrXa10的R基因[34],提示可在水稻遠緣種或非寄主植物中發掘抗條斑病的R基因,以期解決水稻中無抗條斑病抗源問題。

3.2 無毒因子(avirulence factor),激活執行者(executor)基因

稻黃單胞菌除條斑病菌的Xop蛋白AvrRxo1被來自玉米的Rxo1識別[35],以及XopQ被本氏煙Nicotianabenthamiana中的ROQ1 [TNL,a nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein with a Toll-like interleukin-1 receptor (TIR) domain]識別[36]外,還沒有發現其他可識別Xop蛋白的R基因。白葉枯病菌抗病基因啟動子中的EBE可作為TALE蛋白的陷阱,如果TALE被捕捉,則該TALE蛋白為無毒因子。這種R基因產物也稱為執行者(executor)(表1),定位于植物細胞的內質網上。這種“基因對基因”關系的“抗病基因-無毒因子”包括:Xa7-AvrXa7[37-38]、Xa10-AvrXa10[39]、Xa23-AvrXa23[40]和Xa27-AvrXa27[41]。非常有意思的是,這些R基因介導的抗性對條斑病并不起作用[42]。目前認為,Xa7和Xa23抗譜較廣,在水稻育種中已被普遍使用[1]。不過研究發現,Xa7和Xa23抗性可被少數白葉枯病菌克服,應當在生產上結合病菌tal基因型檢測,合理利用Xa7和Xa23抗性[1,43]。

3.3 逃逸子(decoy),逃逸NLR類抗病性

水稻Xa1抗病基因是水稻上第一個被克隆的NLR類R基因[46],約20年后人們才發現稻黃單胞菌多種典型結構的tTALE蛋白均可激活Xa1使水稻表現出抗性,而iTALE可抑制其抗性[21-22]。后來陸續發現了Xa1的等位基因Xa2、Xa14、Xa45(t)、Xo1等NLR類R基因,它們的差異主要在93個氨基酸組成的LRR單元的重復數不同[47-48]。iTALE的發現揭示了白葉枯病菌和條斑病菌利用iTALE逃逸Xa1抗性的原因,并且iTALE在95%以上的病菌群體中存在[22, 48]。更為重要的是,不同于胞質內的NLRs,Xa1等NLR類蛋白定位在植物細胞核,并且tTALE激活Xa1不依賴于TALE與EBE的結合。揭示細胞核中NLR類抗性機制,有助于利用Xa1類R基因培育抗兩種細菌病害的水稻新品種。

3.4 轉錄因子(transcription factor),與水稻基礎轉錄因子γ亞基形成轉錄復合體

稻黃單胞菌TALE蛋白識別水稻R或S基因啟動子中的EBE,轉錄調控R或S基因的表達,前提是TALE蛋白需要與水稻基礎轉錄因子γ5亞基(OsTFIIAγ5)形成轉錄復合體,才能保證R或S基因精準轉錄[45, 49-50]。OsTFIIAγ5也稱為Xa5,當其39位氨基酸由纈氨酸變成為谷氨酸時(xa5),既抗白葉枯病[51],又抗條斑病[16],原因在于TALE蛋白不能與xa5結合形成轉錄復合體[45, 49]。當水稻中存在xa5時,含有PthXo7的白葉枯病菌仍能導致病害發生,原因在于PthXo7誘導了OsTFIIAγ1的表達,彌補了xa5的缺陷[49]。因此,含有xa5抗病基因的水稻,例如‘IRBB5’‘白香占’‘白絲占’和‘白粳占’,可抗白葉枯病和條斑病兩種水稻細菌病害[1,52]。

4 用于水稻白葉枯病和條斑病防控的殺菌劑

我國使用農用鏈霉素、葉枯唑、噻枯唑、噻菌銅、壬菌銅等農藥防治水稻白葉枯病和條斑病已近30年,病原菌已產生了抗藥性[53]。隨后噻唑鋅問世,并在此基礎上組合5%春雷霉素和35%噻唑鋅研發的40%春雷·噻唑鋅懸浮劑,解決了水稻細菌和真菌病害兼治問題[54-55]。同時利用生物農藥防控水稻白葉枯病和條斑病的研究也取得突破性進展,解淀粉芽胞桿菌BacillusamyloliquefaciensLx-11已被登記生產和使用[56]。最近報道,從水稻稻樁上分離的摩氏假單胞菌Pseudomonasmosselii923菌株,產生一種新型的小分子化合物咪唑三嗪(pseudoiodinine),對水稻稻瘟病、白葉枯病和條斑病均顯示了較好的生物防治效果,有望發展為綠色農藥[57]。

5 水稻白葉枯病和條斑病綠色防控策略

根據稻黃單胞菌tal基因型與水稻抗病基因型的對應關系[1]以及與感病基因型的對應關系(表1),我國白葉枯病和條斑病的防控,應遵循以下三種防控模式(圖2)。模式1:白葉枯病發生區,種植Xa7或Xa23抗病水稻品種。模式2:條斑病發生區或兩種細菌病害混合發生區,種植xa5高抗水稻品種。經過多年多點實踐,模式1和2對水稻兩種細菌病害的防控效果達94%以上,無需使用農藥,或在病害零星發生時安慰性使用1次藥劑(Lx-11解淀粉芽胞桿菌懸浮劑或40%春雷·噻唑鋅懸浮劑)進行防控。模式3:無xa5、Xa7和Xa23抗病水稻品種種植區,兩種細菌病害發病初期使用40%春雷·噻唑鋅懸浮劑或Lx-11解淀粉芽胞桿菌懸浮劑1次,滅點保片;多雨季節,兩種農藥交替使用1～2次,防病效果也可達70%以上。

圖2 綠色防控水稻白葉枯病和條斑病模式Fig.2 Green control strategies for bacterial leaf blight and bacterial leaf streak in rice