小白菊內酯對地塞米松誘導的成骨細胞增殖和分化的影響

張卓 劉鵬* 買若鵬 苗磊 陸釗罡 董夢婷

1.寧夏回族自治區人民醫院脊柱與骨腫瘤外科,寧夏 銀川 750000

2.寧夏回族自治區人民醫院臨床藥學室,寧夏 銀川 750000

3.寧夏回族自治區人民醫質量管理辦公室,寧夏 銀川 750000

糖皮質激素具有抗炎和免疫抑制活性,已廣泛應用于自身免疫和炎性疾病的治療。長期使用糖皮質激素會對骨骼產生多種不良影響,包括骨質疏松癥。研究顯示,糖皮質激素抑制成骨細胞的增殖與分化,是糖皮質激素誘導骨量丟失的重要機制[1-2]。目前,尚缺乏緩解糖皮質激素誘導骨質疏松的方法。地塞米松為臨床使用較多的糖皮質激素之一,可通過抑制成骨細胞的Wnt信號通路,從而抑制成骨細胞的增殖與成骨分化并促進其凋亡,誘導骨質疏松[3-5]。Wnt/β-catenin信號通路在骨正常生長和代謝中發揮重要作用,激活Wnt/β-catenin信號通路,可促進成骨細胞的增殖,促進骨折愈合[6-7]。小白菊內酯(parthenolide,PTL)是從草本類植物艾菊中提取的活性物質,具有抗炎、抑制破骨細胞活性、促進成骨細胞分化的作用[8]。研究顯示,PTL可抑制地塞米松誘導的細胞質糖皮質激素受體從細胞質到細胞核的轉運,是糖皮質激素受體向細胞核轉運的抑制劑之一[9]。此外,PTL是Wnt/β-catenin信號通路的調節劑,在炎癥環境中PTL可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞分化[10]。然而,小白菊內酯是否通過調節Wnt/β-catenin信號通路影響地塞米松誘導的MC3T3-E1成骨分化尚未見報道。因此,本研究旨在探索小白菊內酯對地塞米松誘導的MC3T3-E1細胞成骨分化影響機制。

1 材料和方法

1.1 細胞與試劑

小鼠成骨細胞株MC3T3-E1購自美國ATCC;小白菊內酯(純度≥99 %)購自美國Santa Cruz公司;β-磷酸甘油鈉(G9422)、維生素C(A7631)、地塞米松(D1576)購自Sigma公司;Wnt抑制劑(DKK1)(HZ0241)購自上海滬震生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(C0038)、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(C3206)、ALP檢測試劑盒(P0321 S)、BCA蛋白檢測試劑盒(P0012)、茜素紅S(ST1078)、BMP2抗體(AF0075)購自碧云天生物技術有限公司;RUNX2(sc-390715)、OCN(sc-390877)、Cyclin D1(sc-8396)、Wnt3a(sc-136163)、β-catenin(sc-7963)購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1細胞增殖實驗:將MC3T3-E1細胞接種至MEM培養基(含10 % FBS+1 %青霉素鏈霉素)培養,待細胞生長至對數期時,以每孔4×104個細胞接種于96孔板中,使用1 μmol/L地塞米松[11]處理細胞,使用DMSO作為對照組(Control組),使用終濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80 μmol/L小白菊內酯與1 μmol/L地塞米松共同處理細胞,培養48 h后,使用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖。

1.2.2細胞分組及誘導培養:將對數生長期MC3T3-E1接種于6孔板中,分為Control組、地塞米松組(Dex組)、小白菊內酯低、中、高濃度組(PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組)、小白菊內酯高濃度+Wnt抑制劑組(PTL-H+DKK1組),其中Dex組使用1 μmol/L地塞米松處理細胞24 h,小白菊內酯低、中、高濃度組分別使用5.0、10.0、20.0 μmol/L的PTL與1 μmol/L地塞米松共同處理MC3T3-E1細胞24 h,PTL-H+DKK1組使用20.0 μmol/L的PTL與200 ng/mL DKK1[12]共同處理MC3T3-E1 細胞24 h后,使用成骨分化誘導培養基(10 μmol/L β-磷酸甘油+10 % FBS+50 μmol/L維生素C+10 μmol/L地塞米松)進行誘導培養,每隔3 d換液培養。

1.2.3ALP染色及活性檢測:成骨分化誘導培養14 d后,收集各組細胞,加入0.1 %的TritonX-100裂解細胞,提取細胞總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度,使用ALP檢測試劑盒檢測ALP活性。

另收集各組細胞,PBS洗滌后,4 %多聚甲醛固定,加入BCIP/NBT ALP試劑避光染色30 min,PBS洗滌,觀察各組染色情況。

1.2.4茜素紅S染色檢測礦化結節:成骨分化誘導培養21 d后,各組細胞加入4 %多聚甲醛固定15 min,再加入1 %茜素紅S染色 20 min,顯微鏡下觀察礦化結節并拍照,每孔加入10 %氯化十六烷基吡啶(CPC)洗去茜素紅后,測定562 nm處吸光度值(OD)。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達:成骨分化誘導培養14 d后,收集各組MC3T3-E1細胞,加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白,采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,取適量蛋白進行SDS-PAGE電泳后轉膜,分別加入RUNX2(1∶1 000稀釋)、OCN(1∶1 000稀釋)、BMP2(1∶1 000稀釋)、Cyclin D1(1∶1 500稀釋)、Wnt3a(1∶1 500稀釋)、β-catenin(1∶1 500稀釋)抗體稀釋液,4 ℃孵育過夜,再加入HRP標記的二抗(1∶1 500稀釋),室溫孵育1 h,加入ECL試劑顯色后,采用Image J軟件,以β-actin為內參,分析各蛋白表達。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 小白菊內酯對地塞米松誘導的MC3T3-E1細胞增殖的影響

經地塞米松誘導的MC3T3-E1細胞增殖活性顯著降低,使用濃度為2.5～80 μmol/L的小白菊內酯與地塞米松共同處理MC3T3-E1細胞48 h后,濃度在5.0 μmol/L以上時,MC3T3-E1細胞增殖活性明顯升高,選擇小白菊內酯濃度為5.0、10.0、20.0 μmol/L進行后續實驗。

表1 小白菊內酯對地塞米松誘導的MC3T3-E1細胞增殖的影響

2.2 小白菊內酯對地塞米松誘導的MC3T3-E1 細胞ALP活性的影響

與Control組相比,Dex組ALP活性顯著降低,ALP染色變淺;與Dex組比較,PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組ALP活性依次升高,ALP染色逐漸加深;與PTL-H組比較,PTL-H+DKK1組ALP活性顯著降低,ALP染色變淺,見圖1與表2。

圖1 各組MC3T3-E1細胞ALP染色

表2 各組MC3T3-E1細胞ALP活性比較

2.3 小白菊內酯對MC3T3-E1 細胞礦化結節的影響

成骨誘導21 d后,Control組可見橘紅色礦化結節,Dex組礦化結節較Control組減少,與Dex組比較,PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組礦化結節加深,結節數增多(P<0.05);與PTL-H組比較,PTL-H+DKK1組礦化結節數減少,見圖2與表3。

圖2 各組MC3T3-E1細胞茜素紅S染色

表3 各組MC3T3-E1細胞礦化檢測結果

2.4 小白菊內酯對MC3T3-E1 細胞成骨分化相關蛋白的影響

與Control組比較,Dex組RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與Dex組比較,PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組MC3T3-E1細胞RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達水平依次升高(P<0.05);與PTL-H組比較,PTL-H+DKK1組RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),見圖3與表4。

注:A:Control組;B:Dex組;C:PTL-L組;D:PTL-M組;E:PTL-H組;F:PTL-H+DKK1組。

表4 各組RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達比較

2.5 小白菊內酯對Wnt/β-catenin通路蛋白的影響

與Control組比較,Dex組Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與Dex組比較,PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組MC3T3-E1細胞Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平依次升高(P<0.05);與PTL-H組比較,PTL-H+DKK1組Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),見圖4與表5。

注:A:Control組;B:C:PTL-L組;D:PTL-M組;E:PTL-H組;F:PTL-H+DKK1組。

表5 各組MC3T3-E1 細胞Wnt/β-catenin相關蛋白表達的影響

3 討論

在不同的病理條件下,骨形成減少和骨吸收增加會導致全身性骨質流失,糖皮質激素引起的骨代謝紊亂,如地塞米松引起的骨質疏松癥,最近備受關注。地塞米松的使用是骨質疏松癥的常見危險因素,地塞米松可抑制成骨細胞的增殖與成骨分化,促進成骨細胞凋亡,誘導骨質疏松[13-14];抑制成骨細胞凋亡,促進其增殖,有助于改善糖皮質激素性骨質疏松癥[15]。

小白菊內酯具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調節成骨細胞增殖、凋亡的作用[16]。李愛國等[17]研究顯示,在TNF-α誘導的人肌腱干細胞中,小白菊內酯可抑制的炎性反應并可能通過β-catenin信號通路促進肌腱干細胞的成骨分化。另有研究顯示,小白菊內酯抑制過氧化氫(H2O2)誘導的成骨細胞凋亡,增加細胞活力,并增加RUNX2、OCN、collagen 1表達水平[18]。小白菊內酯對地塞米松誘導的MC3T3-E1細胞的作用尚不清楚,本研究使用濃度為2.5～80 μmol/L的小白菊內酯處理地塞米松誘導的MC3T3-E1細胞,結果顯示,小白菊內酯濃度大于5.0 μmol/L以上可明顯促進細胞增殖,選擇濃度為5.0、10.0、20.0 μmol/L進行后續實驗。研究顯示,小白菊內酯通過激活Wnt/β-catenin信號通路,增加ALP活性、礦化結節形成和成骨相關基因/蛋白表達,促進成骨細胞從人牙槽骨分化[10]。ALP是參與骨形成的酶類,是成骨細胞分化的標志物;Runx2基因參與成骨細胞分化過程,并調控OCN、OPN等基因轉錄;BMP-2是誘導成骨的因子[19-20]。本研究結果顯示,使用小白菊內酯與地塞米松共同處理MC3T3-E1 細胞后,ALP活性、礦化結節呈濃度依賴性升高,RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達水平呈濃度依賴性升高,表明小白菊內酯可促進地塞米松誘導的MC3T3-E1 細胞成骨分化,但其具體作用機制尚不清楚。

本研究還顯示,Wnt/β-catenin信號通路可能在小白菊內酯促進地塞米松誘導的成骨細胞增殖與分化過程中起調節作用。Wnt/β-catenin是調節骨生長與代謝的重要通路,促進成骨細胞的增殖與成熟[21]。Wnt3a是Wnt/β-catenin通路的重要分子,通過調控β-catenin表達參與成骨分化過程[22]。Wnt/β-catenin信號通路在糖皮質激素誘導的骨質疏松癥中具有重要意義,研究顯示,在接受糖皮質激素治療的全身性自身免疫性疾病患者中,Wnt抑制劑DKK1的血清水平在糖皮質激素治療1周后顯著增加,血清Wnt3a水平呈下降趨勢;且地塞米松可增加正常人成骨細胞(NHOst)中DKK1的mRNA和蛋白表達[23]。Wnt/β-catenin信號激活可促進地塞米松處理的MC3T3-E1細胞的成骨分化和礦化,并提高成骨相關因子的水平,表明Wnt/β-catenin信號可能是針對糖皮質激素誘發的骨質疏松癥的治療靶點[24]。本研究結果顯示,使用小白菊內酯與地塞米松共同處理MC3T3-E1細胞后,Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平顯著升高,且呈濃度依賴性,提示小白菊內酯可能激活Wnt/β-catenin信號通路,而使用Wnt抑制劑DKK1后,成骨細胞ALP活性、礦化結節顯著降低,RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達水平受到抑制,證實小白菊內酯可激活Wnt/β-catenin信號通路,減輕地塞米松對成骨細胞增殖與分化的抑制作用,促進MC3T3-E1細胞的增殖與分化。

綜上所述,小白菊內酯通過激活Wnt/β-catenin信號通路,減輕地塞米松對成骨細胞增殖與分化的抑制作用,但本研究僅對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白進行檢測,其具體作用機制仍需結合動物模型做進一步研究。