激光散射法測定那他霉素粒度研究

孫 超,康 帥,王冬燕,高福然,程啟東

(1.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司,河北石家莊 052165; 2.微生物藥物國家工程研究中心,河北石家莊 052165; 3.河北省工業微生物代謝技術創新中心,河北石家莊 052165; 4.華北制藥華勝有限公司,河北石家莊 052160)

那他霉素(natamycin)又名匹馬菌素或游霉素,為白色或淡黃色結晶性粉末,是由納塔爾鏈霉菌經發酵得到的一種大環內酯類抗菌劑,在體外它具有抗多種絲狀真菌(如念珠菌、青霉菌和鐮刀霉菌等)和酵母菌的作用[1-2]。那他霉素分子的疏水部分以范德華力和真菌細胞質膜上的甾醇分子相結合,形成多烯固醇復合物,破壞細胞質膜的滲透性,引起真菌內氨基酸及電解質等重要物質的滲出,從而達到滅殺真菌細胞的作用[3-4]。那他霉素滴眼液是治療真菌性角膜炎和角膜潰瘍最常用藥物之一,且因其良好的治療效用,成為大多數眼病患者的首選藥物。

由于那他霉素為難溶性藥物,在制劑中以固體微粒的形式存在。因此,原料藥的粒度大小對其制劑產品質量和療效影響較大。不同粒度原料藥制備的制劑,在體內的吸收、分布和治療效果不同。若因粒度大小及分布不均使得療效不穩定,引發不良反應增加,可能會導致使用安全問題[5-7]。因此,對那他霉素原料藥粒度進行測定和控制是很有必要的。

在原料藥和藥物制劑的質量標準中,粒度分布已經成為一個較為重要的檢測項目。粒度分布的測定方法有篩分法、沉降法、顯微鏡法和激光散射法等[8],其中激光散射法因具有快速、方便和樣品用量小等優點,成為一種常用的粒度分布測定方法。激光散射法是依據米氏理論和弗朗霍夫散射理論,通過測量散射光強度完成粒度測定,被廣泛應用于原料藥粒度大小和分布的質量控制[8-10]。吳燕等[11]與沈丹丹等[12]對激光散射法與顯微鏡法進行了對比研究,2種測定方法結果沒有顯著差異,但顯微鏡法測定速度慢,樣品量少,代表性不強,只適合粒度分布范圍較窄的樣品。張洪英等[13]采用新帕泰克激光粒度儀建立了一種干法測定鹽酸莫西沙星原料藥粒度的方法,并對此方法進行了驗證,但驗證內容僅包括重復性,沒有考察隨機變動因素(如日期、分析人員、儀器)及測定參數微小變化對測定結果的影響。鄧銀來等[14]采用Mastersizer 2000激光粒度儀建立了濕法測定替格瑞洛原料藥粒度的方法,并對該方法進行了驗證,驗證內容僅包括重復性和中間精密度試驗,也沒有考察測定參數微小變化對測定結果的影響。

筆者參照2020年版《中華人民共和國藥典》(四部)[15](以下簡稱《中國藥典》)及Mastersizer 2000激光粒度儀說明書,對激光散射法測定那他霉素粒度的關鍵參數進行了優選,開發了一種那他霉素粒度的測定方法。并依照人用藥品技術要求國際協調理事會(ICH)關于分析方法驗證(以下簡稱:ICH Q2(R1))指南、現行《中國藥典》和《美國藥典》第429章關于粒度光衍射測量(以下簡稱:USP〈429〉)指導原則[16],在重復性和中間精密度試驗的基礎上增加了耐用性試驗,使驗證內容更加科學嚴謹。

1 實驗條件與測定方法

1.1 儀器與試劑

Mastersizer 2000激光粒度儀,由馬爾文帕納科公司提供;T-1000型電子天平,由常熟雙杰測試儀器廠提供;那他霉素原料藥(批號:YFNT220201,YFNT220202,YFNT220203),由華北制藥華勝有限公司提供。

1.2 測定方法

首先,稱取0.5 g樣品置于瓶中(或袋中),輕搖使樣品混合均勻。然后,將樣品置于干法進樣器的進樣盤中,關閉進樣器蓋子,采用Mastersizer 2000激光粒度儀干法測定、通用模型分析模式、標準文丘里管進行測定,測定參數:分散氣壓為0.30 MPa,振動進樣速度為45%,背景和測量掃描時間為10 s,樣品折射率為1.50,顆粒吸收率為0.1,遮光度范圍為0.5%～5%,每個試樣重復測定2次。

2 測定參數的選擇

2.1 分散氣壓的選擇

對于粒度較小的顆粒,其分散狀態是決定測定結果是否準確的關鍵因素,分散氣壓過小,樣品顆粒容易聚集,分散氣壓過大,樣品顆粒則會被分散氣流吹碎導致測定結果偏小[17]。本研究將振動進樣速度設為45%,測量時間設為10 s,分散氣壓分別設置0.20,0.25,0.30,0.35和0.40 MPa,測定那他霉素的粒度,結果見表1。

表1 不同分散氣壓下的粒度測定結果

由表1可知,隨著分散氣壓的增大,粒度的測定結果呈減小趨勢,分散氣壓為 0.25～0.35 MPa時,平均殘差均小于1%。分散氣壓為0.30 MPa時,平均殘差最小,表明在該分散氣壓下,顆粒分散效果最好,因此選擇分散氣壓為0.30 MPa。

2.2 進樣速度的選擇

通過激光散射法測定粒度時,樣品通過振動盤進入系統,振動進樣速度過快,遮光度太高,易發生多重衍射,進樣速度過慢則樣品的流動會出現中斷,影響測定的準確度。本研究將分散氣壓設為0.30 MPa,測量時間設為10 s,振動進樣速度分別設置為40%,45%和50%,測定那他霉素的粒度,結果見表2。

表2 不同振動進樣速度下的粒度測定結果

由表2可知,當設定分散氣壓為0.30 MPa,進樣速度為40%～50%時,粒度的測定結果平均殘差均小于1%,進樣速度為45%時,平均殘差最小,因此選擇振動進樣速度為45%。

2.3 測量時間的選擇

將分散氣壓設為0.30 MPa,振動進樣速度設為45%,測量時間分別設置為5,10和15 s,測定那他霉素的粒度,結果見表3。

表3 不同測量時間的粒度測定結果

由表3可知,當設定分散氣壓為0.30 MPa,振動進樣速度為45%,測量時間分別為5,10和15 s時,平均殘差均小于1%,粒度測定結果基本一致,測量時間為5 s時,樣品用量小于0.2 g,測定結果代表性差,綜合考慮,選擇測量時間為10 s。

3 方法驗證

3.1 重復性試驗

按“1.2”項下的測定參數,測定那他霉素原料藥的粒度,連續測定6次,統計6次D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)的均值及相對標準偏差(RSD),結果見表4。

表4 重復性試驗結果(n=6)

由表4可知,6組數據的D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)的RSD分別為2.2%,5.4%和2.3%,說明該方法重復性良好。

3.2 中間精密度試驗

按“1.2”項下的測定參數,由2名試驗人員分別進行那他霉素原料藥粒度的測定,連續測定6次,與表4的6組數據一起計算RSD,結果見表5。

表5 中間精密度試驗結果

由表5可知,試驗人員1測定后D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)的RSD分別為2.1%,5.4%和2.3%,試驗人員2測定后D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)的RSD分別為1.8%,1.5%和0.7%,說明該方法中間精密度良好。

3.3 耐用性試驗

分別考察分散氣壓((0.30±0.03)MPa)、振動進樣速度(45%±5%)發生微小變化對那他霉素原料藥粒度測定結果的影響。

1)在測定分散氣壓0.30 MPa基礎上,調整分散氣壓為0.27 MPa和0.33 MPa,按照“1.2”項描述的方法分別測定3次,與表4前3組數據一起計算RSD,結果見表6。

表6 耐用性(分散氣壓)試驗結果

由表6可知,當分散氣壓為(0.30±0.03) MPa時,D(0.1)、D(0.5)和D(0.9)的RSD分別為2.4%,5.1%和3.4%,該方法耐用性良好。

2)在振動進樣速度45%基礎上,調整進樣速度分別為40%和50%,按照“1.2”項描述的方法分別測定3次,與表4前3組數據一起計算RSD,結果見表7。

表7 耐用性(振動進樣速度)試驗結果

由表7可知,當振動進樣速度為45%±5%時,D(0.1)、D(0.5)和D(0.9)的RSD分別為1.6%,4.9%和3.0%,該方法耐用性良好。

4 樣品測定與討論

4.1 樣品測定

按“1.2”項下儀器參數測定3批那他霉素原料藥粒度分布,統計各批次樣品的D(0.1)、D(0.5)和D(0.9)的平均值及RSD,各批次原料藥粒度分布測定結果的RSD均符合要求,結果詳見表8。

表8 原料藥的粒度測定結果

4.2 討 論

激光粒度儀測定方式有濕法和干法2種。采用濕法測定樣品粒度分布,方法開發過程繁瑣,需要考察分散介質的種類、超聲時間、攪拌速度、表面活性劑的種類與濃度等對測定結果的影響,并且濕法測定時間長、樣品池不易清洗,同時使用有機分散劑會污染環境。本研究根據那他霉素的理化性質,選擇干法方式測定粒度分布,操作簡單、準確度高,并且對主要測定條件包含分散氣壓、振動進樣速度和測量時間等進行了優選。在光學參數設置方面,因干法測定的分散介質為空氣,空氣的折射率為1.00,因此本方法中折射率選擇儀器默認值1.50。吸收率在0到1之間,其中淺色粉末為0.1,故本方法選擇吸收率為0.1。按照《中國藥典》附錄要求,控制檢測器遮光度范圍為0.5%～5%。

USP〈429〉指導原則要求,激光散射法測定粒度分布的中心值D(0.5)的RSD應小于10%,D(0.1)和D(0.9)的RSD均應小于15%,當D(0.5)小于10 μm時,粒度分布特征值的RSD限度可放寬1倍。本研究依據USP〈429〉指導原則要求,將方法學考察結果和樣品測定結果的RSD標準適當收窄,設定各項考察結果RSD為小于10%。

ICH Q2(R1)指南和《中國藥典》分析方法驗證指導原則[15]規定,典型的驗證項目包括:線性、范圍、專屬性、精密度、準確度、耐用性、檢測限、定量限等。但粒度測定儀器不能對樣品中的不同組分進行區分,所以線性、專屬性、準確度、檢測限、定量限不適用于粒度測定方法的驗證。USP〈429〉指導原則中,激光散射法測定粒度的驗證項目包括重復性和中間精密度。本研究根據馬爾文帕納科公司培訓資料,在USP〈429〉指導原則基礎上,進行了重復性、中間精密度和耐用性的驗證試驗,使激光散射法測定粒度方法的驗證內容更加科學嚴謹。

5 結 語

本研究基于那他霉素粒度分布測定的質量需求,使用Mastersizer 2000激光粒度儀,建立了激光散射法測定那他霉素粒度的方法,并對所開發的方法進行了方法學驗證,所得結論如下。

1)該方法在重復性、中間精密度的基礎上增加了耐用性試驗,各項驗證指標相對標準偏差均符合要求。

2)按照所確定方法連續進行了3批樣品的測定,其D(0.1)、D(0.5)和D(0.9)的RSD均小于2.5%,表明該方法的準確度及穩定性良好,可用于那他霉素原料藥的粒度測定和生產中的粒度質量控制。

本研究建立的激光散射法測定那他霉素粒度方法操作簡單、精密度高、重復性好,能夠有效控制原料藥的批間差異,可為生產出安全、有效、均一、穩定的制劑產品提供保障。

本研究尚未對原料粒度與制劑療效進行相關性分析,下一步的研究工作可通過繼續研究粒度與制劑產品療效的關系,來精準控制那他霉素原料藥的粒度,進一步提高其制劑工藝和制劑產品的穩定性。