基于UPLC指紋圖譜的西洋參飲片、標準湯劑、配方顆粒的質量相關性研究

馬智玲,陳敬然,杜微波,張志強,沈建梅

(1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所,北京 100700;2.北京康仁堂藥業(yè)有限公司,北京 101301;3.中藥配方顆粒關鍵技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,北京 101301;4.北京市中藥配方顆粒工程技術研究中心,北京 101301)

西洋參為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliumL.的干燥根,具有補氣養(yǎng)陰、清熱生津等功效[1],主要包括三萜皂苷、多糖、黃酮、甾體、蛋白質、脂肪、揮發(fā)油、維生素、微量元素等化學成分[2-3],現(xiàn)代研究表明這些化學成分具有顯著的抗腫瘤、抗缺氧、抗疲勞、抗病毒、抗氧化等藥理活性[4-5],能夠有效改善和治療多種疾病。

西洋參配方顆粒以標準湯劑作為物質基礎,經水提、濃縮、干燥和制粒后,失去了原有飲片的外觀形態(tài),在加熱過程中,部分不耐高溫的化學成分可能發(fā)生變化,且2020年版《中華人民共和國藥典》(一部)“西洋參”項下僅限于對單個人參皂苷的含量控制,未對其他藥理活性成分及配方顆粒制備過程中的物質轉化進行質控,然而中藥發(fā)揮療效通常取決于有效成分的綜合作用。故針對西洋參飲片、標準湯劑及配方顆粒的物質傳遞過程中各有效成分進行質量相關性研究尤為重要。

目前,關于西洋參的質量研究主要集中于藥材和飲片[6-8],而西洋參服用方式多為另煎兌服或配方制劑,對于西洋參及其他配方顆粒中物質的量值傳遞規(guī)律的現(xiàn)有研究中,通常采用相似度、峰相對保留時間及峰數(shù)目等方式進行定性評價[9-12],或者采用傳統(tǒng)的指標成分轉移率進行定量評價[13-15],而采用指標成分轉移率進行定量評價時需要具有對照品進行隨行參照,對于無對照品參照的成分,無法有效獲取相應物質傳遞的量值情況,極大地限制物質傳遞規(guī)律的評價。湯成成等[9]與劉野婷等[13]采用HPLC法建立了西洋參標準湯劑及配方顆粒的指紋圖譜,研究表明各特征峰均能夠穩(wěn)定存在,但二者的分析時間較長,且未對飲片至標準湯劑和配方顆粒過程中的化學成分變化情況和傳遞規(guī)律進行分析。因此本研究采用的高效液相色譜(UPLC)指紋圖譜方法,建立西洋參飲片、標準湯劑、配方顆粒的UPLC指紋圖譜,不僅可以評估中藥材的質量,還可以評估不同制劑之間的質量相關性、相似性和量質傳遞規(guī)律,既省時省力又能實現(xiàn)定性和定量控制,可為中藥的藥理研究和臨床應用提供重要的數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

LC-30AD超高效液相色譜儀,TUV Detector紫外檢測器,均由日本島津公司提供;Agilent 6530 Q-TOF高分辨飛行時間質譜儀,美國Agilent公司提供;JY20002百分之一天平,上海舜宇恒平科學儀器有限公司提供;ME104E萬分之一天平,上海梅特勒·托利多儀器有限公司提供;KQ-500DB超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司提供;電子恒溫水浴鍋DZKW-4,北京中興偉業(yè)儀器有限公司提供。色譜柱Thermo Accucore C18(2.1 mm×150 mm,2.6 μm),賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供。

色譜純乙腈,賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供;蒸餾水,廣州屈臣氏食品飲料有限公司提供;分析純甲醇,國藥集團化學試劑有限公司提供。

對照品詳細信息見表1。18批西洋參飲片(編號 :Y1—Y18)均經北京康仁堂藥業(yè)有限公司王孝濤傳承工作室于立偉執(zhí)業(yè)藥師鑒定為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliumL.的干燥根,飲片產地見表2。西洋參標準湯劑(編號:D1—D18)及配方顆粒(編號:K16—K18)樣品由18批飲片一一對應制備。

表1 對照品信息表

表2 樣品信息表

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Thermo Accucore C18(2.1 mm×150 mm,2.6 μm);以乙腈(A)-水(B)為流動相,梯度洗脫程序為0～8 min,5%A→20%A;8～14 min,20%A;14～20 min,20%A→26%A;20～28 min,26%A;28～29 min,26%A→30%A;29～38 min,30%A→40%A;38～48 min,40%A→43%A,檢測波長為203 nm,流速為0.4 mL/min。理論板數(shù)按人參皂苷Rb1峰計算不得低于10 000。

2.2 對照品溶液的制備

取西洋參對照藥材1.0 g,置于錐形瓶中,加水25 mL,加熱回流30 min,過濾,取續(xù)濾液10 mL于20 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度線,超聲處理(功率為250 W,頻率為40 kHz)30 min,取出,冷卻,搖勻,過濾,取續(xù)濾液作為藥材對照品溶液。另取人參皂苷Rg1,Re,Rb1對照品適量,精密稱定,加乙腈-水(體積比為20∶80)混合溶液分別制成質量濃度為15 μg/mL的人參皂苷Rg1,0.40 mg/mL的人參皂苷Re,0.50 mg/mL的人參皂苷Rb1的溶液,作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

按要求從西洋參飲片、標準湯劑、配方顆粒中取適量樣品,研細,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入50%(體積分數(shù),下同)甲醇50 mL,密塞,稱定質量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,冷卻,再稱定質量,用50%甲醇補足減失的質量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得。其中飲片稱樣量為3.0 g,標準湯劑、配方顆粒及陰性樣品稱樣量為0.5 g。

3 結果分析和評價

3.1 含量測定

3.1.1 專屬性試驗

分別精密吸取“2.2”項混合對照品貯備液、空白溶劑和“2.3”項陰性樣品、西洋參配方顆粒供試品溶液,按“2.1”項檢測,結果表明供試品色譜與混合對照品色譜在同一保留時間處有相同色譜峰,空白溶劑及陰性樣品無干擾,表明該方法專屬性良好。

3.1.2 精密度試驗

精密吸取“2.2”項混合對照品溶液,按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6次,計算3號峰人參皂苷Rb1峰面積的RSD為0.37%,表明儀器精密度良好。

3.1.3 重復性試驗

取西洋參配方顆粒(編號為K16)6份,按“2.3”項方法處理,進樣檢測,計算人參皂苷Rg1,Re,Rb1總含量的RSD為0.80%,表明方法重復性良好。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗

取“2.3”項下西洋參配方顆粒供試品溶液1份,于0,2,4,8,12,24 h測定,計算人參皂苷Rg1,Re,Rb1峰面積的RSD分別為3.0%,1.6%,1.9%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

3.1.5 加樣回收率試驗

取人參皂苷Rg1,Re,Rb1對照品適量,精密稱定,加50%甲醇溶液制成每1 mL含人參皂苷Rg19.30 μg,Re 101.37 μg,Rb1386.12 μg的混合對照品儲備液。取西洋參配方顆粒(編號為K16)粉末適量9份,每份約0.25 g,精密稱定,分為3組,分別精密加入人參皂苷Rg1,Re,Rb1混合對照品儲備液5,10,15 mL,精密加入50%甲醇溶液45,40,35 mL,按“2.3”項方法制成加樣回收供試品溶液9份,按“2.1”項色譜條件進樣測定,計算加樣回收率,結果見表3。人參皂苷Rg1,Re,Rb1的平均回收率分別為100.2%,97.8%,97.2%,回收率結果均在92%～105%,RSD均小于3.0%,表明該方法準確可靠。

表3 回收率試驗結果

3.1.6 線性關系考察

取人參皂苷Rg1,Re,Rb1對照品適量,精密稱定,加50%甲醇溶液制成人參皂苷Rg1系列對照品溶液(0.002 60,0.005 10,0.010 20,0.020 50,0.041 0,0.082 0 mg/mL)、人參皂苷Re系列對照品溶液(0.010 4,0.020 9,0.052 2,0.104,0.209,0.522 mg/mL)、人參皂苷Rb1系列對照品溶液(0.092,0.153,0.256,0.426,0.710,1.184,1.973 mg/mL),分別吸取10 μL進樣,測定其峰面積,以質量濃度(x)為橫坐標,峰面積(y)為縱坐標,計算回歸方程。結果如表4所示,表明人參皂苷Rg1,Re,Rb1在各自的線性范圍內線性關系良好。

表4 線性關系結果表

3.1.7 樣品含量測定

分別精密吸取“2.2”“2.3”項混合對照品和供試品溶液10 μL,按“2.1”項色譜條件測定,計算人參皂苷Rg1,Re,Rb1的總量。西洋參飲片人參皂苷Rg1,Re,Rb1總量范圍為4.6%～6.3%;標準湯劑總量范圍為6.2%～10.2%,轉移率范圍為49%～91%,依據(jù)制成量折算成配方顆粒總量范圍為4.1%～6.8%;3批顆粒的總量范圍為5.0%～5.5%,轉移率區(qū)間為55.6%～61.0%,均在標準湯劑標準區(qū)間之內。說明飲片、標準湯劑、配方顆粒制備過程工藝成熟、穩(wěn)定,能夠保證配方顆粒的臨床藥效。

3.2 指紋圖譜

3.2.1 方法學驗證

3.2.1.1 精密度試驗

精密吸取“2.3”項同一供試品(編號為K16)溶液,按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6次,以3號特征峰人參皂苷Rb1為參照峰,計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD,結果均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

3.2.1.2 重復性試驗

將“3.1.3”所獲得的色譜圖,以3號特征峰人參皂苷Rb1為參照峰,計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD,結果均小于3.0%,表明方法重復性良好。

3.2.1.3 穩(wěn)定性試驗

將“3.1.4”所獲得的色譜圖,以3號特征峰人參皂苷Rb1為參照峰,計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD,結果均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

3.2.2 指紋圖譜的建立

按“2.3”項供試品溶液制備方法分別制備18批次的西洋參飲片、標準湯劑及3批次的配方顆粒供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進行檢測,記錄色譜圖。導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”,進行色譜圖匹配,分別得到三者的指紋圖譜共有模式,同時分別生成西洋參飲片、標準湯劑及其配方顆粒的對照圖譜,結果見圖1—圖4。三者的指紋圖譜共確定了8個共有峰。并通過對照品指認了其中5個峰,分別為峰1(人參皂苷Rg1),峰2(人參皂苷Re)、峰3(人參皂苷Rb1)、峰4(人參皂苷Rc)和峰6(人參皂苷Rd)。

圖1 西洋參飲片UPLC指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprint of American Ginseng pieces

圖2 西洋參標準湯劑UPLC指紋圖譜Fig.2 UPLC fingerprint of American Ginseng standard decoctions

圖3 西洋參配方顆粒UPLC指紋圖譜Fig.3 UPLC fingerprint of American Ginseng formula granules

圖4 西洋參飲片、標準湯劑及配方顆粒的對照指紋圖譜Fig.4 Reference map of American Ginseng pieces, standard decoctions and formula granules

根據(jù)所獲得色譜圖,確定西洋參指紋圖譜的評價方式:供試品色譜中應呈現(xiàn)8個特征峰,并應與對照藥材參照物色譜峰中的8個特征峰保留時間相對應,與人參皂苷Rb1峰相應的峰為S峰,計算各特征峰與S峰的相對保留時間,峰1、峰2相對保留時間應在規(guī)定值的±20%范圍之內,其余峰相對保留時間應在規(guī)定值的±5%范圍之內,規(guī)定值分別為0.45(峰1)、0.46(峰2)、1.00(峰S)、1.02(峰4)、1.07(峰5)、1.09(峰6)、1.13(峰7)、1.22(峰8)。

3.2.3 指紋圖譜的辨識

取供試品溶液,按“2.1”色譜條件,利用高效液相串聯(lián)高分辨飛行時間質譜儀獲得其質譜圖,通過對特征圖譜的紫外光譜信息及所采集的一級質譜圖信息的研究,同時參考文獻對西洋參中的主要化學成分進行結構推測,并配制主要化學成分人參皂苷Rg1,Re,Rb1,Rc,Rd的對照品溶液,按色譜條件進行檢測比對,推斷供試品溶液特征圖譜中各特征峰,結果見圖5、表5及圖6所示。

圖5 對照品峰指認圖譜Fig.5 Peak identification atlas of reference substance

圖6 西洋參配方顆粒203 nm色譜圖、陽離子總離子流圖Fig.6 Chromatogram and total cation flow diagrams at 203 nm of American Ginseng formula granules

表5 西洋參配方顆粒指認化合物

通過與對照品對比,確定峰1為人參皂苷Rg1、峰2為人參皂苷Re、峰3為人參皂苷Rb1、峰4為人參皂苷Rc、峰6為人參皂苷Rd(見圖5)。

3.2.4 相似度評價

分別將不同批次的西洋參飲片、標準湯劑及其配方顆粒的指紋圖譜與相應的對照指紋圖譜相比較,結果見表6。不同批次西洋參三者的指紋圖譜與相應的對照圖譜的相似度范圍分別為0.976～1.000,0.988～1.000和0.995～0.999。將三者的對照指紋圖譜進行相似度分析,結果見表7。西洋參飲片的8個共有峰在西洋參標準湯劑及配方顆粒中均有所體現(xiàn),三者的對照指紋圖譜的相似度達到0.95以上,表明西洋參飲片、標準湯劑及其配方顆粒指紋圖譜非常相似,在化學成分種類上具有一致性,差異很小。西洋參配方顆粒的8個共有峰在西洋參飲片中均可追溯,傳遞過程中沒有出現(xiàn)色譜峰丟失的情況,表明西洋參配方顆粒的質量較穩(wěn)定,可以代替飲片應用于臨床。

表6 18批西洋參飲片、標準湯劑及其配方顆粒相似度結果

表7 西洋參飲片、標準湯劑及其配方顆粒對照指紋相似度結果

3.3 量值傳遞分析

3.3.1 飲片至標準湯劑物質傳遞分析

按照“3.2.2”項獲得18批西洋參飲片及標準湯劑的色譜圖,以樣品濃度、出膏率和8個共有特征峰峰面積按公式(1)計算K值,分析飲片至標準湯劑物質傳遞情況,結果見表8。并按公式(2)計算已知峰的轉移率,結果見表9。結果表明K值能夠科學地分析標準湯劑的物質量值傳遞規(guī)律,且該K值的獲取無需成分對照品的引入,分析更加簡便。

表8 18批西洋參飲片至標準湯劑的K值

表9 18批西洋參飲片至標準湯劑含量轉移率

(1)

(2)

人參皂苷Rg1,Re,Rb1,Rc,Rd的K值分別為0.12～0.35,0.12～0.36,0.17～0.50,0.15～0.49和0.17～0.56。對于含量轉移率平均值和K值平均值,人參皂苷Rg1為0.15和0.17;人參皂苷Re為0.16和0.18;人參皂苷Rb1為0.18和0.21;人參皂苷Rc為0.25和0.20;人參皂苷Rd為0.30和0.23。由于18批次標準湯劑與飲片檢測條件存在一定差別,因此K值與含量轉移率數(shù)值存在略微區(qū)別,但K值與含量轉移率的趨勢一致,表明在不需要使用對照品的前提下,K值基本能描述多種成分物質的變化趨勢。

西洋參標準湯劑8個特征峰的K值范圍較大,分析其原因主要是目前原料的質量差異較大導致的。若以該范圍值作為參照,則會出現(xiàn)工藝偏差。鑒于原料質量差異問題不可避免,因此選擇符合標準湯劑范圍的同批次的中藥材飲片制備得到的標準湯劑K值作為參照,對工藝研究進行質控,保證所得終產品與標準湯劑的一致性。

西洋參作為名貴的滋補藥材,具有補氣養(yǎng)陰,清熱生津之功效。現(xiàn)代研究認為,西洋參中的皂苷類成分既是其功效成分也是其主要活性物質。通過分析西洋參標準湯劑的8個特征峰的18批次K值,除個別批次外都小于0.30,其中特征峰多為皂苷類成分,可知西洋參皂苷類成分轉移的趨勢基本一致。因此可以選擇對人參皂苷Rg1,Re,Rb1,Rc,Rd進行控制,進而控制西洋參中皂苷類成分的轉化。故確定西洋參的工藝關鍵控制成分為峰1(人參皂苷Rg1)、峰2(人參皂苷Re)、峰3(人參皂苷Rb1)、峰4(人參皂苷Rc)、峰6(人參皂苷Rd)代表的成分。

3.3.2 飲片、配方顆粒全過程物質傳遞分析

以同批次標準湯劑中的K值均值作為可接受轉化程度的標準對生產工藝進行篩選,篩選出最佳工藝條件。在該工藝條件下制得3批西洋參配方顆粒,3批次西洋參配方顆粒的工藝過程中的各中間產物以及最終西洋參配方顆粒的峰1—峰4和峰6的K值結果如表10所示。

表10 西洋參工藝研究過程中的K值變化

3批西洋參配方顆粒在研究過程中的各峰量值傳遞的K值趨勢一致。通過K值確定的工藝關鍵控制點對顆粒制備過程進行質控后,峰1、峰2、峰3、峰4及峰6的K值均與相應批次標準湯劑K值接近,并均在標準湯劑范圍內。可以確定制備得到的顆粒與標準湯劑藥效物質基礎一致性較好,因此,進一步確定上述3批次的工藝條件制備得到的顆粒均符合要求。綜上可知:采用K值確定的工藝關鍵屬性能夠保證配方顆粒臨床應用的藥效及安全性。

2021年國家藥監(jiān)局發(fā)布的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》中,明確要求中藥材、中藥飲片、中間體、中藥配方顆粒特征圖譜或指紋圖譜應具相關性,并具有明確的量質傳遞規(guī)律[16]。K值的獲取無需成分對照品的引入就能夠進行多成分分析,科學合理地評價西洋參飲片中的各成分的量值傳遞規(guī)律。因此,可以用于實現(xiàn)西洋參中藥配方顆粒、其中間產物、含西洋參飲片的經方或者其中間產物中各類已知或未知物質的量值傳遞規(guī)律的評價,更好地保證西洋參配方顆粒或經方的臨床應用的安全性。西洋參飲片、凍干粉、配方顆粒的內在質量具有相關性,因此,可以通過加強對原料藥的質量控制,達到獲得穩(wěn)定均一的中藥配方顆粒的目的。

4 結 語

該研究對西洋參從飲片到配方顆粒的生產環(huán)節(jié)中人參皂苷Rg1,Re,Rb1總量及指紋圖譜采用UPLC法同時測定,并通過對指紋圖譜的測定結果進行相似度和K值分析。所得結論如下。

1)人參皂苷Rg1,Re,Rb1總含量及轉移率范圍均符合量值傳遞規(guī)律,總量質量相關性較強;西洋參飲片、標準湯劑、配方顆粒的特征圖譜基本一致,均標示8個主要特征峰,且相似度均在0.90以上,表明西洋參配方顆粒與標準湯劑的成分基本一致,在生產過程中物質傳遞良好。

2)所構建的評價方法可降低檢測成本,測定方法通過方法學驗證,簡單便捷,結果準確可靠,能夠作為內控質量標準。

3)K值的提出克服了現(xiàn)有技術中在無對照品參照的情況下,不能夠有效用于西洋參各種物質的量值傳遞規(guī)律的評價的問題,從而提供一種評價西洋參物質量值傳遞規(guī)律的方法;該評價指標無需對照品,也能夠有效對西洋參飲片制備可得到的樣品中的物質的量值傳遞規(guī)律進行評價,也可為其他品種的配方顆粒、經典名方或其他制劑形式的量質傳遞規(guī)律的研究提供了思路。

中藥發(fā)揮療效通常取決于有效成分群的綜合作用,本研究僅以西洋參中重要活性成分皂苷為研究對象,未對多糖類、黃酮類等其他化學成分進行質量控制,故后續(xù)研究應著重對其他類成分進行方法的建立及質量控制,以更全面、準確地把控藥物生產過程中藥效成分的轉移,從而發(fā)揮更好的療效。