咖啡酸苯乙酯對HepG2細胞氧化應激和脂質代謝的調節作用

劉 暢，常 超，陳瑞達，林萌慧，孫 蓉，蔡成崗，趙敏潔，蔡海鶯,,3,*

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058；3.美欣達集團有限公司，浙江 湖州 313002）

隨著居民膳食結構的變化，高脂膳食攝入的不斷增加成為日益顯著的現象，過量攝入的高脂膳食會導致機體物質和能量代謝失衡[1]，引起體質量增加、脂肪積累、氧化應激提高以及系統性炎癥[2-3]，并且伴隨著肥胖、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）、代謝綜合征等多種疾病的產生[4-5]。引起人們廣泛關注的脂代謝紊亂也和高脂膳食的過量攝入關系密切[6]，當大量的能量被吸收后，未被消耗的能量會在脂肪組織中儲存[7]，脂肪積累在現有的脂肪細胞中，從而增大細胞體積，然而脂肪細胞儲存脂肪的能力有限，多余的脂肪無法被脂肪組織吸收，從而引起血液、肝臟等的功能紊亂，而脂肪組織的擴大會逐漸導致肥胖[8-9]。咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）是來源于蜂膠中的天然活性物質[10]，具有許多生物學特性，如抗氧化、免疫調節、抗腫瘤[11-13]等。Sun Lulu等[14]的研究表明，CAPE具有改善脂代謝紊亂的作用，其能夠調節不同組織脂代謝的多個信號通路，改善高脂膳食脂肪合成調控的一系列關鍵基因的表達，抑制組織中的脂肪細胞分化，減少脂肪的積累。遲樂[15]研究發現，CAPE通過調節過氧化物酶體増殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ）、CCAAT/增強子結合蛋白α（enhancer binding protein α，CEBPα）和轉化生長因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）信號通路影響3T3-L1細胞生成脂肪，抑制脂質合成相關轉錄因子和下游相關因子的表達，顯著降低細胞中甘油三酯（triglyceride，TG）含量和甘油-3-磷酸脫氫酶的活性，具有潛在的抗肥胖作用。有研究顯示，CAPE可通過抑制糖尿病小鼠和人肝臟腫瘤細胞（HepG2）模型的應激，活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）炎癥信號通路，改善胰島素抵抗[16]。目前這些研究都只集中于CAPE調節脂代謝的生化指標測定以及信號通路的驗證，對于其直接作用的位點尚不明確。本研究用CAPE處理油酸誘導的HepG2細胞高脂肪模型，通過轉錄組測序，對2.5 μmol/L CAPE及高脂肪組的細胞進行測序，擬從轉錄組水平分析CAPE處理后HepG2細胞的基因表達差異，進而對基因進行富集分析，同時篩選出與脂代謝相關的基因，以期揭示CAPE調節脂代謝的潛在機理，為改善由高脂膳食引起的脂代謝紊亂提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CAPE、油酸、油紅O 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MEM（minimum essential medium）培養基、HepG2細胞 武漢普諾賽生命科技有限公司；TRIzol試劑南京諾唯贊生物科技股份有限公司；CCK-8細胞活力試劑盒、TG試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）試劑盒、總蛋白定量試劑盒（BCA法） 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺、CO2細胞培養箱、Sorvall? ST 8小型臺式離心機 美國賽默飛世爾科技有限公司；CKX53倒置顯微鏡 日本Olympus公司；SpectraMax iD3多功能酶標儀 北京眾力挽生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞處理

將復蘇后的HepG2細胞培養至細胞密度達80%～90%，進行傳代培養。HepG2細胞培養在10%（質量分數，下同）胎牛血清混合1%青霉素-鏈霉素試液的MEM完全培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，常規換液、傳代，當細胞處于對數生長期時取出進行實驗。參考文獻[17]的結果，使用0.2 mmol/L的油酸誘導HepG2細胞形成高脂肪模型的效果最佳，因此將細胞分為正常組（NCD）、高脂肪組（HFD）、高脂肪＋處理組（包括HFD＋7.5 μmol/L CAPE（CAPE7.5）、HFD＋5 μmol/L CAPE（CAPE5）、HFD＋2.5 μmol/L CAPE（CAPE2.5）、HFD＋2 μmol/L CAPE（CAPE2）、HFD＋1 μmol/L CAPE（CAPE1）），每組設置6 個平行對照，對處理后的細胞進行染色觀察，在冰水浴條件下超聲破碎細胞（300 W超聲3～5 s/次，間隔20 s）后進行理化指標檢測，選出降脂效果最優組別進行轉錄組水平分析。

1.3.2 指標檢測

1.3.2.1 CCK-8細胞活力檢測

細胞按照正常組（NCD）、高脂肪組（HFD）、高脂肪＋處理組（包括HFD＋10 μmol/L CAPE、HFD＋7.5 μmol/L CAPE、HFD＋5 μmol/L CAPE、HFD＋2.5 μmol/L CAPE、HFD＋2 μmol/L CAPE、HFD＋1 μmol/L CAPE）分組，使用CCK-8試劑盒檢測各處理組細胞活力。

1.3.2.2 油紅O染色觀察及吸光度測定

正常組、高脂組及高脂肪＋處理組細胞棄掉舊培養液并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）潤洗2 次后，加入200 μL質量分數4%多聚甲醛溶液，將孔板轉移到4 ℃冰箱內固定20 min，棄廢液，用PBS潤洗2 次，24 孔板中每孔加入200 μL 油紅O染色10 min。待染色觀察樣品采用60%（體積分數，下同）異丙醇或70%乙醇溶液快速潤洗，吸去廢液，每孔加入1 mL PBS后在顯微鏡下觀察拍照；待測吸光度樣品使用60%異丙醇或70%乙醇溶液[18]萃取油紅O，室溫放置20 min，將萃取出的染液以500 μL/孔轉移至24 孔培養板中，測定其在490 nm波長處吸光度[19]。

1.3.2.3 細胞內TG和T-CHO水平測定

分別收集各處理組細胞并制備成勻漿液。參照相應試劑盒說明書，測定各組HepG2細胞內的TG、T-CHO水平，并通過定量細胞中的蛋白進行標準化處理。

1.3.2.4 計算機預測靶點

通過S w i s s T a r g e t P r e d i c t i o n（h t t p://swisstargetprediction.ch/）數據庫[20]檢索CAPE的作用靶蛋白及對應基因，通過GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫[21]檢索脂代謝相關靶點基因，將結果導入STRING（https://string-db.org/）數據庫構建共有靶點基因的蛋白相互作用關系網絡[22]。使用DAVID（https://david.ncifcrf.gov）數據庫[23]對共有的靶點基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。以核心靶點基因編碼蛋白為受體、CAPE為配體，采用AutoDock4軟件進行分子對接，模擬CAPE調節脂代謝靶點。

1.3.2.5 細胞轉錄組樣本處理及轉錄組測序分析

根據實驗結果，對調節脂代謝指標效果較顯著的HFD＋2.5 μmol/L CAPE組進行轉錄組水平分析。取對數生長期[24]的HepG2細胞，以5×105個/孔接種于6 孔細胞板中，每個條件設置3 組平行，即HFD-1、HFD-2、HFD-3（HFD組）和CAPE-1、CAPE-2、CAPE-3（HFD＋2.5 μmol/L CAPE組）。待細胞密度達到80%左右[25]，加入0.2 mmol/L油酸將細胞誘導成高脂肪模型。培養24 h后，處理組棄去舊液，加入0.2 mmol/L油酸＋2.5 μmol/L CAPE混合培養液。孵育24 h后，用移液槍吸去孔板中的細胞培養基，每孔加入質量分數0.25%胰酶1 mL，消化細胞3～5 min，吸取MEM完全培養基5 mL終止細胞消化，收集細胞后轉入10 mL離心管中，4 ℃、200×g離心5 min，棄上清液，再加入3 mL PBS重懸，重復離心步驟，細胞沉淀中加入5×106個/mL TRIzol試劑[26]，吹打混勻，1 mL/管分裝入1.5 mL RNase-free離心管中，液氮速凍0.5 h，包埋在干冰中送樣。細胞樣品RNA質量檢測及轉錄組分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。轉錄組測序步驟：利用Illumina測序平臺對基因序列進行高通量轉錄組測序；通過Fastp軟件對原始測序序列5’→3’的堿基質量及測序數據中A、T、G、C堿基含量進行評估，將與分析標準不符合的讀數（reads）刪除，保留對后續分析有幫助的高質量讀數（clean reads）。

1.3.2.6 差異表達基因功能注釋及富集分析

通過Hisat2軟件進行基因序列比對分析，綜合蛋白質直系同源簇（clusters of orthologous groups of proteins，COG）、非冗余蛋白庫（non-redundant protein sequence database，NR）、基因本體（gene ontology，GO）、KEGG、蛋白質序列數據庫（Swiss-Prot protein sequence database，Swiss-Prot）、蛋白質家族數據庫（protein families database，Pfam）對所表達的基因進行注釋；利用DESeq2、DEGseq和edgeR軟件進行基因表達量差異分析。差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選標準：|log2FC|≥1（FC：實驗組基因表達量/對照組基因表達量）且P≤0.05。采用美吉生信云分析平臺（https://cloud.majorbio.com/）對基因集中的基因/轉錄本進行KEGG通路富集分析[27]，當P＜0.05時認為該通路富集顯著。

1.4 數據統計分析

采用Origin 2019軟件對數據進行分析與處理，并用GraphPad prism6軟件作圖，實驗數據以平均值±標準差表示，數據間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 CAPE對油酸誘導HepG2細胞脂質代謝的影響

根據文獻[28-29]報道，CAPE在高于20 μmol/L時具有一定細胞毒性，CCK-8細胞活力檢測結果顯示，10 μmol/L CAPE顯著降低細胞活力，而CAPE濃度為7.5、5、2.5、2、1 μmol/L時，HepG2細胞的活力均保持在98%以上，因此，確定調節脂代謝的CAPE濃度為1～7.5 μmol/L。采用油紅O染色觀察各組細胞脂滴積累情況，并于490 nm波長處測定其吸光度。和NCD組相比，HFD組油紅O染色效果變化顯著（圖1），說明油酸誘導高脂肪模型建模成功。根據染色效果及吸光度結果分析，在CAPE濃度為2.5 μmol/L時，其對脂質積累的抑制效果最為顯著。對改善脂肪積累效果最佳的處理組和高脂肪組（即2.5 μmol/L CAPE組和HFD組）進行轉錄組分析，并對2 組細胞進行油紅O染色以確定處理效果，結果如圖2A、B所示。和HFD組相比，CAPE 2.5組細胞脂肪積累水平顯著降低。進一步測定破碎細胞中TG及T-CHO水平，經過蛋白校準后的細胞TG和T-CHO水平變化如圖2C、D所示。與HFD組對比，CAPE 2.5組細胞中TG水平有明顯的下降趨勢，但CAPE處理對于膽固醇代謝調節效果不顯著，這進一步證明CAPE干預具有明顯緩解高脂細胞模型中脂滴積累的效果。

圖1 經CAPE處理的HepG2細胞染色觀察及吸光度Fig.1 Observation and absorbance of stained HepG2 cells treated with CAPE

圖2 經2.5 μmol/L CAPE處理HepG2細胞的染色及指標檢測Fig.2 Observation and characterization of stained HepG2 cells treated with 2.5 μmol/L CAPE

2.2 經CAPE處理的HepG2細胞轉錄組測序及DEGs分析

對CAPE處理的HepG2細胞與高脂肪組細胞進行轉錄組測序及DEGs分析，CAPE組和HFD組經過過濾后的序列數量（即clean reads數目）分別有47 575 973 條和47 867 835 條，所占比例分別為96.07%和96.03%，根據經CAPE處理的HepG2細胞中基因表達的變化情況，共篩選出3 270 個DEGs。其中，表達上調的DEGs有1 351 個，表達下調的DEGs有1 919 個，DEGs表達模式聚類見圖3。

圖3 DEGs表達模式聚類Fig.3 Clustering analysis of DEGs expression pattern

2.3 經CAPE處理的HepG2細胞DEGs KEGG通路功能注釋及富集分析

為進一步明確DEGs的功能，對HFD組及CAPE組之間的DEGs進行KEGG功能注釋分析。如圖4所示，DEGs分別注釋到代謝、遺傳信息的處理、環境信息處理、細胞過程、有機系統和人類疾病中。經CAPE處理的HepG2高脂肪模型細胞的DEGs在脂代謝上有相關注釋，說明脂代謝相關基因在CAPE的影響下產生差異性表達。

圖4 KEGG通路功能注釋分析Fig.4 Functional annotation analysis of KEGG pathways

前15 條顯著富集的KEGG通路如表1所示，表中比例表示相應KEGG通路在目標基因集中所占比例，分子為基因集中富集到該KEGG通路的基因或轉錄本數目，分母為該基因集中具有KEGG注釋的基因或轉錄本總數目，將P＜0.05定義為該功能顯著富集，可以發現顯著富集的通路主要集中在代謝和信號轉導上。對DEGs進行KEGG通路富集分析，發現DEGs主要參與果糖和甘露糖代謝（fructose and mannose metabolism）、糖酵解/糖異生（glycolysis/gluconeogenesis）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、脂肪酸降解（fatty acid degradation）等。進一步分析KEGG通路中與脂質代謝和氧化應激相關的主要富集信號通路基因轉錄水平發現，在HIF-1α信號通路上DEGs顯著富集，推測CAPE通過HIF-1α通路改善高脂誘導的HepG2細胞氧化應激，從而改善脂代謝紊亂和氧化應激壓力；另外，多個脂肪酸降解通路相關關鍵基因表達量差異顯著，脂肪酸代謝上游調控基因PPARα表達也發生上調，而PPARα信號通路與脂肪酸分解代謝[30-31]關系密切。與GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）[21]靶點預測結果一致，CAPE對肝臟細胞具有多個作用靶點，其通過與靶點的相互作用調節脂代謝相關的多個代謝通路。Sun Lulu等[14]所進行的小鼠實驗結果顯示，CAPE能夠調節不同組織脂代謝的多個信號通路以及脂肪合成的一系列關鍵基因的表達，改善高脂膳食小鼠脂代謝紊亂，說明CAPE對脂代謝調節具有多靶點作用。

2.4 CAPE調節HepG2細胞HIF-1α通路改善氧化應激

轉錄組DEGs分析顯示，CAPE處理能上調高脂誘導細胞的HIF-1α基因轉錄表達水平（提高了0.326 倍），并且顯著調節HIF-1α下游厭氧呼吸等通路基因PDK1、HK1、PFKP、PFKFB3、LDHA、ALDOC、ENO1、PGK1、EGLN3的表達（表2），表明CAPE處理能調節HIF-1α通路。另外，CAPE組細胞RTK、MEK、elf4E相關基因表達相較于高脂肪組分別上升了1.5、1.37、1.2 倍，且4E-BP1表達量下降了42%，表明CAPE可能通過MEK-ERK-4E-BP1-elf4E通路上調HIF-1α的表達（圖5）。計算機輔助預測發現，mTOR和MAPK相關的蛋白激酶為CAPE的潛在作用靶點，表明CAPE分子能通過與潛在靶點相互作用，影響HIF-1α蛋白翻譯表達。進一步分析顯示，CAPE組中參與HIF-1α泛素化降解通路的基因PHD表達量降低，表明CAPE處理能抑制泛素化介導的HIF-1α蛋白降解，提高HIF-1α蛋白積累水平。因此，CAPE處理能調節HIF-1α的翻譯和泛素化降解，促進機體無氧呼吸的進程，緩解高脂處理細胞的氧化應激壓力。氧化應激在脂代謝紊亂及相關疾病中的重要作用備受矚目[32]。研究表明，機體氧化應激的增加常伴隨脂質的異常堆積加劇以及脂質從頭合成的顯著改變[33]。另外，活性氧和炎癥誘導的氧化應激能夠導致脂質過氧化、線粒體和過氧化物酶體的脂肪酸氧化功能損傷，并促進細胞因子釋放，進一步加劇炎癥和肝細胞纖維化，這是酒精性脂肪肝和其他肝臟疾病的主要發展機制[34]。

表2 HIF-1α通路DEGs表達Table 2 Expression of DEGs associated with HIF-1α signaling pathway

圖5 CAPE調節HIF-1α通路的潛在機制分析Fig.5 Analysis of the underlying mechanism of CAPE regulation of HIF-1α signaling pathway

2.5 CAPE調節HepG2細胞脂肪酸分解代謝通路

經KEGG信號通路基因差異表達分析發現，CAPE能改善高脂HepG2細胞的脂肪酸分解代謝和PPARα信號通路相關多個基因的表達（表3）。PPARα通路參與調節脂肪酸轉運、脂肪酸氧化[35]、脂肪酸降解及膽固醇代謝等重要脂代謝通路。如圖6所示，相較于高脂肪組，CAPE組細胞PPARα下游與脂肪酸氧化代謝相關的蛋白表達量明顯上升，如肉堿棕櫚酰轉移酶I（carnitine palmotoyltransferase I，CPT1）和肉堿棕櫚酰轉移酶II（carnitine palmotoyltransferase II，CPT2），其中調控CPT1、CPT2、PPARα表達的CPT1A、CPT2、PPARα基因分別上調了1.039、0.755、0.661 倍，調控脂肪酸結合蛋白5表達的FABP5基因上調了1.598 倍，表明CAPE處理促進了細胞內脂肪酸的活化進程。另外，CAPE組高脂誘導細胞脂肪酸β氧化進程相關酶基因表達上調，在脂肪酸β氧化的氧化、水合、脫氫、硫解[36]4 個過程中，調控?；o酶A脫氫酶（acyl-coenzyme A dehydrogenase，ACADM）合成的基因ACADM表達量上升了0.38 倍，編碼長鏈?；o酶A脫氫酶（acyl coenzyme a dehydrogenase very long chain，ACADVL）合成的基因ACADVL表達量上升了0.39 倍；調控烯醇輔酶A水合酶S1（enoylcoenzyme A hydratase S1，ECHS1）和烯酰輔酶A 水合酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHA）合成的基因ECHS1及HADHA表達量分別升高了0.2 倍和0.31 倍；調控L-β-羥脂酰CoA脫氫酶（hydroxyacylcoenzyme A dehydrogenase，HADH）合成基因HADH表達量提高了1.42 倍；編碼脂酰CoA硫解酶（cetyl-coenzyme A acyltransferase，ACAA）合成的基因ACAA1和ACAA2表達量分別沒有變化和提高了0.47 倍，促進了長鏈脂肪酸的氧化分解。由此可知，CAPE處理可能通過PPARα通路和脂肪酸β氧化通路改善高脂誘導HepG2細胞內的脂代謝。

表3 PPARα通路DEGs表達Table 3 Expression of DEGs associated with PPARα signaling pathway

圖6 CAPE調節脂肪酸分解的潛在通路分析Fig.6 Analysis of the underlying pathways of CAPE regulation of fatty acid breakdown

對CAPE調節脂代謝作用具體機制的研究表明，可能存在多種作用靶點和調節通路以及組織和細胞特異性[37]。遲樂[15]對3T3-L1脂肪細胞研究發現，CAPE通過調節PPAR-γ、CEBPα和TGF-β信號通路影響脂肪合成，抑制脂質合成相關轉錄因子和下游相關因子的表達，發揮抗肥胖的作用。Nie Jiarui等[16]研究發現，CAPE可通過抑制糖尿病小鼠和HepG2細胞模型的JNK和NF-κB炎癥信號通路改善胰島素抵抗和糖脂代謝。最近有研究表明，CAPE能顯著抑制小鼠腸道菌群膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）活性，提高膽汁酸中?；铅?鼠膽酸含量，從而選擇性抑制膽汁酸法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR），抑制高脂膳食引起的神經酰胺含量升高和脂肪生成，同時改善胰高血糖素樣肽-1（glucagonlike peptide-1，GLP-1）分泌，改善小鼠NAFLD[38]。另外，金銘等[39]利用25-羥固醇（25-hydroxycholesterol，25-OHC）通過14-3-3η信號蛋白研究蛋白組磷酸化修飾作用誘導肝臟上皮L02細胞的脂代謝紊亂，發現CAPE可通過泛素化依賴途徑促進14-3-3η信號蛋白降解，進而逆轉25-OHC誘導的肝臟細胞脂代謝紊亂。有別于小鼠實驗以及脂肪細胞體外實驗研究，本研究采用HepG2細胞體外實驗和轉錄組測序高通量篩選方法，進一步分析CAPE對脂肪酸誘導的高脂肪模型細胞的直接作用靶點。研究發現，CAPE對肝細胞同樣具有多重靶點，與脂代謝相關的作用通路包括調節HIF-1α通路（緩解高脂細胞氧化應激）和脂肪酸分解代謝通路。CAPE通過調節HIF-1α的翻譯和泛素化降解，促進機體無氧呼吸的進程，緩解高脂處理細胞的氧化應激壓力，改善細胞代謝微環境和脂代謝紊亂；CAPE處理可能通過調節PPARα通路和脂肪酸β氧化通路多個關鍵基因表達從而改善高脂誘導HepG2細胞內的脂代謝。

3 結 論

CAPE對細胞脂代謝的改善機制和關鍵靶基因的研究并不完善，本研究結果顯示，CAPE可以顯著影響油酸誘導的HepG2高脂肪模型細胞的基因表達譜，表明CAPE調節脂代謝的靶點具有多重性。KEGG信號通路富集分析結果表明，CAPE的主要調節通路包括HIF-1α通路和脂肪酸降解通路，CAPE處理促進高脂細胞模型中HIF-1α的表達，并抑制了HIF-1α蛋白的泛素化降解，通過對下游調節基因表達的調控，緩解肝細胞內的氧化應激并改善細胞微環境。此外，受CAPE影響的高脂細胞模型PPARα通路被激活，與脂肪酸轉運和氧化代謝相關的CPT1、CPT2等蛋白表達量升高，表明CAPE也可通過PPARα通路調節細胞內脂肪酸氧化分解，改善脂代謝。本研究為CAPE調節脂代謝的分子機制研究提供了一定的理論依據，為膳食干預高脂膳食引起的脂代謝紊亂提供參考。