鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的方法研究

江 燕，張先華，徐興利，王祖煥，葉世春

（重慶健能醫藥開發有限公司，重慶 401121）

糜爛性胃炎和消化性潰瘍與膽汁反流及胃液中膽汁酸濃度有關［1］，膽汁中的膽酸可溶解胃液中的黏液（黏液有保護胃黏膜作用）和破壞黏膜表層細胞，從而破壞胃黏膜的屏障作用。膽汁酸包括游離型和結合型兩類，結合型膽汁酸是膽汁反流中對胃黏膜造成損害的主要物質。鋁碳酸鎂是一種具有層狀網絡晶格的藥物，能阻斷損傷因子，有效保護胃黏膜［2-3］。有研究報道，鋁碳酸鎂等抗酸劑對膽汁酸具有較強的吸附能力，能有效清除反流入胃的膽汁酸［4-5］。分析膽汁酸常用的方法有薄層色譜法［6-7］、氣相色譜法［8］和高效液相色譜（HPLC）法［9-10］。本研究中建立了膽汁酸的體外吸附方法及含量測定的HPLC 法，對鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附各膽汁酸的能力進行了考察，為臨床合理用藥提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；MS205DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；PHS - 3C pH 計（上海雷磁儀器有限公司）；TDL - 80 - 2B 型離心機（上海安亭科學儀器公司）；HH-ZK4型水浴鍋（鞏義市予華儀器公司）。

1.2 試藥

牛磺膽酸鈉對照品（Sinco 公司，批號為19 - 03 -0110，含量為95.25%）；甘氨膽酸鈉對照品（批號為1-CYJ- 39 - 1，含量為98%），牛磺鵝脫氧膽酸鈉對照品（批號為9-MMS- 9-1，含量為97%），牛磺脫氧膽酸鈉對照品（批號為1-NYL-90-1，含量為95%），甘氨鵝脫氧膽酸鈉對照品（批號為5 - YFD - 138 - 1，含量為95%），均購于TRC 公司；鋁碳酸鎂咀嚼片（四川健能制藥有限公司，批號分別為20200801，20201001，20201002，20201003，規格為每片0.5 g）；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 體外吸附膽汁酸

參考文獻［4-5］并結合前期預試驗結果，選擇鋁碳酸鎂咀嚼片細粉為吸附形態，以0.1 mol/L 的鹽酸溶液（pH 1.0）為介質。取濃度為0.5 mmol/L（質量濃度為0.25 mg/ mL）膽汁酸鹽溶液5 mL，加入鋁碳酸鎂咀嚼片細粉中，于（37±5）℃水浴中孵育1 h，離心分離。

按公式計算鋁碳酸鎂咀嚼片對5 種膽汁酸的吸附率，吸附率(%) =(1-A樣品/A對照)× 100%。其中，A樣品為供試品溶液峰面積，A對照為對照品溶液峰面積。

2.2 膽汁酸含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（40∶40∶50，V/V/V，用磷酸調pH 至3.0）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：200 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。結果系統適用性溶液中，各膽汁酸鹽對照品色譜峰的理論板數不大于2 000，拖尾因子不大于2.0，分離度不低于1.5。詳見圖1。

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖1.Sodium taurocholate 2.Sodium glycocholate hydrate 3.Sodium taurochenodeoxycholate 4.Sodium taurodeoxycholate hydrate 5.Sodium glycochenodeoxycholateFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

2.2.2 溶液制備

系統適用性溶液：分別取甘氨膽酸鈉對照品、牛磺膽酸鈉對照品、甘氨鵝脫氧膽酸鈉對照品、牛磺鵝脫氧膽酸鈉對照品、牛磺脫氧膽酸鈉對照品各25 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 鹽酸溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

對照品貯備液：取5 種膽汁酸對照品各25 mg，精密稱定，分別置100 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 鹽酸溶液制成濃度為0.5 mmol/L（質量濃度為0.25 mg/mL）的對照品貯備液。

對照品溶液：取上述對照品貯備液各5 mL，分別置離心管中，于（37 ± 0.5）℃水浴中孵育1 h，每隔10 min振搖混勻，離心（轉速為2 000 r/ min）15 min，取上清液，即得。

供試品溶液：取鋁碳酸鎂咀嚼片細粉適量（相當于鋁碳酸鎂25 mg），精密稱定，分別置離心管中，加入上述對照品貯備液各5 mL，于（37±0. 5）℃水浴中孵育1 h，每隔10 min 振搖混勻，離心（轉速為2 000 r/min）15 min，取上清液，即得。

2.2.3 方法學考察

定量限確定：取2.2.2項下單個對照品溶液逐級稀釋，以信噪比（S/N）為10∶1 時的質量濃度為定量限濃度，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，結果牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、牛磺鵝脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、甘氨鵝脫氧膽酸鈉的定量限分別為1.257，1.252，2.452，2.396，2.395μg/mL。采用定量限濃度的對照品溶液連續進樣測定6 次，結果5 種膽汁酸保留時間的RSD分別為0.16%，0.10%，0.14%，0.11%，0.21%（n= 6）；峰面積的RSD分別為2.52%，5.14%，4.55%，6.18%，8.04%（n=6）。結果均低于10.0%，符合要求。

線性關系考察：精密量取2.2.2項下對照品貯備液適量，分別稀釋成濃度為定量限濃度，以及0.05，0.10，0.125，0.15，0.20 mg/ mL 的系列溶液，取系列溶液及對照品貯備液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以溶液質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察結果Tab.1 Results of the linear relation test

重復性試驗：按2.2.2項下供試品溶液制備方法制備溶液，平行6 份，按2.2.1 項下色譜條件由同一試驗人員進樣測定。結果鋁碳酸鎂咀嚼片對5種膽汁酸的吸附率為35.59%～97.25%，RSD為0.28%～3.83%（n=6），表明方法重復性良好。

中間精密度試驗：按2.2.2項下供試品溶液制備方法制備溶液，由另一試驗人員在不同日期平行配備6份，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定；同時，取重復性試驗項下6次試驗數據。結果2位試驗人員測定的12份供試品溶液中，鋁碳酸鎂咀嚼片對5 種膽汁酸的吸附率為35.59%～97.88%，RSD為0.41%～2.26%（n= 12），表明中間精密度良好。

穩定性試驗：取2.2.2項下對照品溶液和供試品溶液各適量，分別于室溫下放置0，6，12，18，24，30，36，48，60，72 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果各膽汁酸峰面積的RSD為0.18%～1.80%（n= 10），保留時間的RSD為0.20%～0.80%（n= 10），表明對照品溶液和供試品溶液在室溫放置72 h內穩定性良好。

回收試驗：取各膽汁酸對照品貯備液，配制成質量濃度分別為0.20，0.125，0.05 mg/ mL 溶液，作為高、中、低質量濃度的質控樣品，按2.2.2 項下方法制備質控樣品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，每個濃度平行測定3 次，并計算方法的絕對回收率。結果見表2，表明吸附過程對膽汁酸濃度測定無干擾，HPLC 法的準確性符合測定要求。

表2 回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.3 樣品中膽汁酸吸附率測定

取樣品（批號分別為20200801，20201001，20201002，20201003），依法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算鋁碳酸鎂咀嚼片對膽汁酸的吸附率。結果見表3。

表3 4批樣品中膽汁酸吸附率測定結果（%）Tab.3 Results of adsorption rate of bile acid in the four batches of samples（%）

3 討論

以膽汁酸為主的十二指腸內容物從胃幽門反流入胃，損傷胃黏膜并引起相關疾病，膽汁酸反流與腸上皮化生及不典型增生的發生密切相關［11］。鋁碳酸鎂能吸附和結合膽汁酸，從而減弱黏膜損傷因子的攻擊，改善局部黏膜的血流量，通過調節pH 值改變黏膜表面的酸堿環境等參與黏膜的保護作用。鋁碳酸鎂在臨床上用于保護膽汁酸引起的胃黏膜損傷和治療膽汁反流性胃炎［12-13］。

目前，尚無國家標準收載鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的方法。本研究中，鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的方法是根據鋁碳酸鎂獨特的層狀網絡結構及其組成（氫氧化鋁、氫氧化鎂及碳酸鹽）進行設計。通過模擬胃部pH值及患者的胃酸量，以及鋁碳酸鎂咀嚼片的用法用量對膽汁酸的吸附能力，確定介質為0.1 mol/L的鹽酸溶液，鋁碳酸鎂咀嚼片的吸附形態為細粉，膽汁酸鹽溶液的濃度為0.5 mmol/L（質量濃度為0.25 mg/mL），吸附時加入膽汁酸鹽溶液5 mL，于（37 ± 0.5）℃水浴孵育1 h，吸附完成后離心分離（轉速為2 000 r / min）15 min。通過改變孵育時間、離心轉速和離心時間、孵育過程中間隔振搖時間等試驗吸附方法進行了耐用性考察，結果表明，在孵育時間變化± 10 min、離心轉速變化±500 r/min、離心時間變化±2 min和振搖間隔時間變化± 10 min 時，5 種結合型膽汁酸吸附率的RSD為0.96%～3.95%，耐用性良好。

國家標準中尚未收載膽汁酸的檢測方法，參考文獻［14 - 16］，本研究中采用HPLC 法對膽汁酸進行分析，但各膽汁酸的峰形及分離度均較差。優化了流動相的組成，選擇甲醇、乙腈和緩沖鹽流動相體系，并對流動相的pH 值和緩沖鹽的濃度，以及對不同的色譜柱進行篩選，各膽汁酸分離更好；通過改變柱溫、流速、流動相pH 值、緩沖鹽濃度等試驗對色譜條件進行了耐用性考察，結果表明，柱溫變化±5 ℃、流速變化±0.1 mL/min、流動相中有機相比例變化±3%、流動相pH值變化±0.2、流動相中磷酸鹽濃度變化±0.005 mol/L 時，5 種結合型膽汁酸吸附率的RSD為0.46%～3.11%，色譜條件耐用性好。

綜上所述，所建立的鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸方法及膽汁酸含量測定方法準確、有效、靈敏、快速，可用于鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的檢測。