黑加侖平脂膠囊制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

高惠靜，袁 圓，馮文玲，吳潔茹，許少全，趙 軍Δ

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830054； 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011）

高脂血癥是多種原因?qū)е碌闹|(zhì)代謝紊亂性疾病，可引發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、胰腺炎、腎衰竭等，是心血管疾病的高危因素［1-2］。《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2015 年）》指出，我國(guó)成人高脂血癥患病率為40.4%［3］。隨著人民生活水平的提高及受不良生活習(xí)慣的影響，高脂血癥發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)［4］。目前，臨床常用的調(diào)脂西藥有他汀類(lèi)、貝特類(lèi)等［5］，雖能有效調(diào)控血脂，但可導(dǎo)致肌病、橫紋肌溶解、2 型糖尿病、抑郁癥、睡眠障礙等藥品不良反應(yīng)［6-7］。中藥調(diào)血脂的藥源豐富，療效確切，配方靈活，毒副作用小，長(zhǎng)期應(yīng)用耐受性好，應(yīng)用前景廣闊。中醫(yī)將高脂血癥納入“血瘀”“痰濕”“脂膏”等范疇，治療以健脾益氣、化痰降濁為主［8］。黑加侖平脂方是維吾爾族常用民間驗(yàn)方，由黑加侖籽、山楂和甘草組方。方中，黑加侖籽為君藥，具有祛痰化瘀、養(yǎng)心健脾功效［9］；山楂為臣藥，具有化瘀血、開(kāi)胃氣功效［10］；甘草為佐藥，具有益心氣、和脾胃功效［11］。該方經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院周銘新教授論證，具有化瘀祛痰、健脾養(yǎng)心的作用，主治高脂血癥［9］。本研究中通過(guò)單因素試驗(yàn)、L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選黑加侖平脂膠囊的制備工藝，并建立其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為產(chǎn)品的后續(xù)開(kāi)發(fā)和轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Clarus500 型氣相色譜儀（美國(guó)PE 公司）；2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；BP211 D 型電子天平（德國(guó)Sartorius公司，精度為十萬(wàn)分之一）；F80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京永光明醫(yī)療儀器廠）；FDV 型超微細(xì)粉粉碎機(jī)（臺(tái)灣佑崎有限公司）；8002 型電子恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；CX31 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；WFH-203B 型暗箱式三用紫外分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；CQ50A 型微型超聲波清洗器（上海超聲波儀器廠，功率為200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

黑加侖籽（新疆維帝食品有限責(zé)任公司，批號(hào)為100923）；山楂（批號(hào)為110903），甘草（批號(hào)為110120），均購(gòu)自安徽省亳州市凱利中藥飲片有限公司；γ-亞麻酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)為110898 - 201605，含量大于98%），金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)為111521-200303，含量大于98%），甘草酸單銨鹽對(duì)照品（批號(hào)為110731 -200409，含量大于98%），熊果酸對(duì)照品（批號(hào)為110742-201622，含量大于98%），甘草次酸對(duì)照品（批號(hào)為110723-200612，含量大于98%），山楂對(duì)照藥材（批號(hào)為121138 - 200302），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)為120904 -200410），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；十七烷酸甲酯對(duì)照品（安普實(shí)驗(yàn)室技術(shù)上海有限公司，批號(hào)為T(mén)2370005，含量不低于98%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黑加侖平脂膠囊制備工藝優(yōu)選

2.1.1 黑加侖籽粉碎方法考察［12］

稱取黑加侖籽1 000 g，共6 份，其中3 份采用低溫超微粉碎，3 份采用普通機(jī)械粉碎，收集通過(guò)80 目篩的細(xì)粉，計(jì)算出粉率（%），采用氣相色譜（GC）法測(cè)定γ-亞麻酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，低溫超微粉碎法的出粉率顯著高于普通機(jī)械粉碎法（P＜0.05），但2 種方法粉碎后的細(xì)粉中γ-亞麻酸含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），這可能與粉碎時(shí)間短有關(guān)，低溫可有效保護(hù)藥材中γ-亞麻酸和超氧化物歧化酶等不穩(wěn)定活性物質(zhì)。故選擇低溫超微粉碎法。

表1 黑加侖籽出粉率和γ-亞麻酸含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.1 Results of flour extraction rate and γ-linolenic acid content of Ribes nigrum seeds（n=3）

2.1.2 山楂提取工藝優(yōu)選

參照本課題組的前期研究方法［13］。采用L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、乙醇用量（因素B）和提取時(shí)間（因素C）進(jìn)行考察，因素與水平見(jiàn)表2；以主要調(diào)脂成分金絲桃苷含量和醇浸出物含量（權(quán)重系數(shù)分別為0.7 和0.3）為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，篩選最佳醇提條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，最佳醇提工藝為A2B2C2，因素A 對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而因素B 和因素C 對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。為節(jié)約成本、節(jié)省工時(shí)，確定最佳提取工藝為A2B1C1，即加10 倍量70%乙醇，回流提取2 次，每次1.0 h。

表2 山楂提取L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平Tab.2 Factors and levels of the L9（34）orthogonal test of Crataegus Fructus

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the analysis of variance

2.1.3 甘草水提工藝優(yōu)選

采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)提取次數(shù)（因素A）、加水量（因素B）和提取時(shí)間（因素C）進(jìn)行考察，因素與水平見(jiàn)表5；以甘草酸含量和水浸出物含量（權(quán)重系數(shù)分別為0.7 和0.3）為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，篩選最佳水提條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，最佳水提工藝為A3B3C3，因素A對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而因素B 和因素C 對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。為節(jié)約成本、節(jié)省工時(shí)，確定最佳提取工藝為A3B1C2，即加10倍量水，回流提取4次，每次1.5 h。

表5 甘草提取L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平Tab.5 Factors and levels of the L9（34）orthogonal test of Glycyrrhizae Radix

2.1.4 水提液除雜工藝優(yōu)選

采用單因素試驗(yàn)對(duì)除雜方法（離心法、ZTC 1+1-Ⅱ型天然澄清劑法和殼聚糖澄清劑法）進(jìn)行考察，以甘草酸和水浸出物含量與保留率（權(quán)重系數(shù)分別為0.5和0.5）為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)［9］，結(jié)果見(jiàn)表6。可見(jiàn)，ZTC 1+1-Ⅱ型天然澄清劑法綜合評(píng)分最高，且ZTC 1+ 1- Ⅱ型天然澄清劑具有無(wú)殘留、兼具矯味、易工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)［14］，故選擇ZTC1+1-Ⅱ型天然澄清劑法進(jìn)行除雜。

表6 水提液除雜工藝考察結(jié)果（n=3）Tab.6 Investigation results of impurity removal process with water extraction liquid（n=3）

篩選出除雜方法后，再對(duì)濃縮比例、澄清劑的用量進(jìn)行考察，由表6 可知，藥材與藥液濃縮比例為1∶20（m/V）時(shí)甘草酸保留率較高，水浸出物保留率較低，綜合評(píng)分最高，故選擇水提液最佳濃縮比例為1∶20（m/V）；澄清劑用量為ZTC 2%A 和1.0%B 時(shí)甘草酸保留率較高，水浸出物保留率較低，綜合評(píng)分最高，故選擇澄清劑用量為ZTC 2%A和1.0%B。

篩選出的黑加侖平脂膠囊最佳制備工藝為，山楂用10 倍量70%乙醇回流提取2 次，每次1.0 h，濾過(guò)，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.10～1.16（60～70 ℃）的清膏；甘草用10 倍量水回流提取4 次，每次1.5 h，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至1∶20（m/V），加入ZTC 1+1-Ⅱ型天然澄清劑除雜，濾過(guò)，濾液與山楂清膏合并后濃縮成相對(duì)密度為1.14～1.20（60～70 ℃）的浸膏；黑加侖籽低溫超微粉碎，過(guò)80 目篩后與上述浸膏混合，加入輔料，使用干燥噴霧制粒機(jī)一步制粒，整粒，灌裝，即得。按此工藝制備3批（批號(hào)分別為19060203，19060303，19060403）黑加侖平脂膠囊，備用。

2.2 黑加侖平脂膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2.2.1 黑加侖籽的顯微鑒別

分別取黑加侖平脂膠囊內(nèi)容物和黑加侖籽粉末，研成細(xì)粉，取少許置載玻片上，滴加水合氯醛試液，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察［15］。結(jié)果二者內(nèi)種皮厚壁細(xì)胞均為橢圓形或多角形，呈棕紅色；胚乳細(xì)胞均為橢圓形或多角形，內(nèi)含眾多顆粒狀物，呈灰白色；石細(xì)胞均為類(lèi)方形或類(lèi)長(zhǎng)方形，胞腔大。詳見(jiàn)圖1。

圖1 黑加侖籽的顯微鑒別圖1.Parenchyma cells 2.Endosperm cells 3.Stone cells A.Ribes nigrum seed powder B.Heijialun Pingzhi CapsulesFig.1 Microscopic identification pictures of Ribes nigrum seeds

2.2.2 薄層色譜鑒別

山楂［16］：取膠囊內(nèi)容物1.0 g，精密稱定，加乙酸乙酯4 mL，超聲15 min，濾過(guò)，濾液濃縮至0.5 mL，作為供試品溶液；另取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液；另取山楂對(duì)照藥材1.0 g，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液；按處方工藝制備缺山楂的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述4種溶液點(diǎn)于同一薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5，V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖2 A。

圖2 薄層色譜圖1.Reference solution 2.Reference medicinal solution 3.Test solution 4.Negative reference solution A.Crataegus Fructus B.Glycyrrhizae Radix（365 nm）Fig.2 TLC chromatograms

甘草［17］：取膠囊內(nèi)容物1.0 g，精密稱定，加鹽酸2 mL、氯仿20 mL，超聲15 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液；另取甘草次酸對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的對(duì)照品溶液；另取甘草對(duì)照藥材1.0 g，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液；按處方工藝制備缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述4 種溶液點(diǎn)于同一薄層板上，以石油醚-苯- 乙酸乙酯- 冰醋酸（10∶20∶7∶0.5，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液顯色，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的黑色斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖2 B。

2.2.3 GC 法測(cè)定γ-亞麻酸含量

1）色譜條件

色譜柱：SupelcoTM彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；檢測(cè)器：氫火焰離子化（FID）檢測(cè)器；載氣：氮?dú)猓恢鶞兀?05 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測(cè)器溫度：275 ℃；分流比：30∶1；進(jìn)樣量：1μL。

2）溶液制備

對(duì)照品溶液：取γ- 亞麻酸甲酯對(duì)照品16.20 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 620μg/mL的溶液，即得。

內(nèi)標(biāo)溶液：取十七烷酸甲酯對(duì)照品19.97 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 997μg/mL的溶液，即得。

供試品溶液：取膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，過(guò)80目篩，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚加熱回流4 h，揮干乙醚，從殘留液中精密稱取100 mg，置10 mL 具塞試管中，加0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液2 mL，60 ℃水浴皂化15 min，待油珠溶解，放冷，加14%三氟化硼甲醇溶液2 mL，60 ℃水浴甲酯化2 min，放冷，精密加入正己烷2 mL，振搖，加飽和氯化鈉溶液2 mL，靜置分層，從上層液中精密量取0.2 mL，置5 mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加正己烷定容，即得［18］。

陰性對(duì)照品溶液：按處方工藝制備不含黑加侖籽的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

3）方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取上述陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液和對(duì)照品溶液中，γ- 亞麻酸甲酯保留時(shí)間一致，樣品中其他組分對(duì)γ-亞麻酸甲酯無(wú)干擾，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。詳見(jiàn)圖3。

圖3 氣相色譜圖1.Methyl heptadecanoate（internal standard） 2.γ-linolenic acid methyl ester A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 GC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取上述對(duì)照品溶液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別置5 mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加正己烷定容，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、對(duì)照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.002 4X-0.024 2（r=0.999 9，n= 6）。結(jié)果表明，γ- 亞麻酸甲酯質(zhì)量濃度在32.4～648.0μg/mL 范圍內(nèi)與對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液峰面積比值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.27%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為19060303）黑加侖平脂膠囊內(nèi)容物適量，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果的RSD分別為0.18%（n= 6）和0.29%（n= 30），表明供試品溶液室溫下放置24 h 穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為19060303）黑加侖平脂膠囊內(nèi)容物6 份，按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.34%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為19060303）黑加侖平脂膠囊內(nèi)容物（γ-亞麻酸甲酯含量為15.17 mg/g）9份，每份15 g，按上述供試品溶液制備方法制備至“靜置分層”，量取上層液0.1 mL，置容量瓶中，分為3組，各3 份，分別精密加入0.40，0.50，0.60 mLγ- 亞麻酸甲酯對(duì)照品溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 γ-亞麻酸甲酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.7 Results of the recovery test of γ-linolenic acid methyl ester（n=9）

4）樣品中γ-亞麻酸的含量測(cè)定

取3批（批號(hào)分別為19060203，19060303，19060403）黑加侖平酯膠囊內(nèi)容物，各平行3 份，按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果3 批樣品中γ-亞麻酸含量分別為（16.35±0.75）mg/g、（15.13±1.21）mg/g、（16.06±1.03）mg/g，平均為15.84 mg/g，計(jì)算得γ- 亞麻酸的含量為15.08 mg/ g。計(jì)算公式為γ-亞麻酸含量=γ-亞麻酸甲酯含量×0.952。

3 討論

3.1 黑加侖平脂膠囊功效

黑加侖為新疆北部地區(qū)塔城、伊犁、阿勒泰等地廣泛種植的一種漿果植物。黑加侖籽是黑加侖漿果榨汁后的主要副產(chǎn)品，常被丟棄或用作飼料。研究表明，黑加侖籽具有抗氧化、調(diào)脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病等藥理學(xué)作用［19］。黑加侖平脂膠囊是從中醫(yī)理論出發(fā)，以黑加侖籽為君藥，經(jīng)典調(diào)脂中藥山楂為臣藥，調(diào)脂中藥甘草為佐藥，組成的調(diào)脂復(fù)方中藥制劑。

3.2 黑加侖籽粉碎方法優(yōu)化

本研究中選擇粉碎后直接入藥，原因有以下三點(diǎn)。1）黑加侖籽中含有具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的超氧化物歧化酶［20］，高溫提取會(huì)破壞這種有效成分。2）籽油易酸敗，穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于籽粉。3）籽粉在膠囊中還具有賦形劑的作用。超低溫粉碎不僅可防止因局部過(guò)熱所致油脂滲出、物料變黏，還可保護(hù)黑加侖籽中不穩(wěn)定有效成分［9］。γ- 亞麻酸是黑加侖籽中主要調(diào)脂活性成分［21］，出粉率是評(píng)價(jià)粉碎工藝損耗多少的關(guān)鍵指標(biāo)，故選擇出粉率和γ- 亞麻酸含量綜合考察黑加侖籽的粉碎方法。

3.3 山楂、甘草提取工藝指標(biāo)選擇

金絲桃苷為山楂調(diào)脂的主要黃酮類(lèi)成分［22］，且為脂溶性成分，故采用醇提取。醇提浸出物量是衡量山楂質(zhì)量的重要指標(biāo)，故本研究中以金絲桃苷含量及醇提浸出物含量作為山楂提取工藝的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。甘草酸為甘草中發(fā)揮調(diào)脂及阻止動(dòng)脈粥樣硬化形成的主要活性成分［23-24］，其為水溶性成分，故采用水提取。水提浸出物量是衡量藥材中有效成分是否提取完全和是否完全轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)［25］。中藥有效成分較復(fù)雜，單一指標(biāo)往往不能衡量工藝的優(yōu)劣。故選擇主要有效成分甘草酸和水提浸出物含量綜合評(píng)價(jià)甘草的提取工藝。由于浸出物量與藥理作用強(qiáng)度不呈量效關(guān)系，故設(shè)定浸出物權(quán)重系數(shù)為0.3；而有效成分含量與藥物的藥理學(xué)作用具有明顯相關(guān)性，故設(shè)定有效成分權(quán)重系數(shù)為0.7。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中優(yōu)選的黑加侖平脂膠囊制備工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定，適于工業(yè)化生產(chǎn)；所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定可靠，可用于黑加侖平脂膠囊的質(zhì)量控制。本研究為黑加侖平脂膠囊的后續(xù)開(kāi)發(fā)和轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。