天胡荽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究*

左登平，李變變，鹿秀葉，趙向陽

（安徽省宿州市食品藥品檢驗檢測中心，安徽宿州 234000）

天胡荽始載于《千金食治》，廣泛分布于安徽、江蘇、浙江、江西、福建、臺灣、湖南、湖北、廣東、廣西等地［1-3］，具有清熱利濕、解毒消腫功效，主治黃疸、痢疾、水腫、淋病、目翳、喉腫、癰腫瘡毒、帶狀皰疹、跌打損傷等癥［4-6］。天胡荽全草含有黃酮苷、酚類、氨基酸、揮發(fā)油、香豆素等化合物，目前已從天胡荽中分離出了4 種黃酮類化合物，8種齊墩果烷型三萜類化合物，1種木質(zhì)素類成分和1 種甾體成分［7-10］。其中，黃酮類成分槲皮素性質(zhì)穩(wěn)定，是研究天胡荽含量及評價天胡荽質(zhì)量的重要指標(biāo)［11-15］。天胡荽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范（2019 年版）》《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1994 年版）》《貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2003 年版）》《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2003 年版）》《湖北省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2018 年版）》等，但相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的項目均不全面，且部分標(biāo)準(zhǔn)中的項目有待進一步完善。本研究中對10 批天胡荽藥材進行性狀、顯微、薄層色譜鑒別，檢查水分、灰分、浸出物的含量，采用高效液相色譜法測定槲皮素的含量，建立并完善天胡荽的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該藥材的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司），配有Chromeleon 色譜工作站；Camag TLC SCANNER3 型薄層掃描儀（瑞士Camag 公司）；DM750 型生物顯微鏡（德國Leica 公司），配有ToupCamE3CMOS 成像系統(tǒng)；FP240 型精密干燥箱（德國Binder 公司）；KSL -1200X - M 型高溫箱式爐（合肥科晶材料技術(shù)有限公司）；TA-27型超聲波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司，功率為700 W，頻率為40 kHz）；BSA 124S型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.1 mg）；AB135 - S 型分析天平（梅特勒-托利多公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為10081-201610，純度為99.1%）；天胡荽藥材樣品（10批，均由安徽省中藥材標(biāo)準(zhǔn)起草領(lǐng)導(dǎo)小組提供），經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉金山教授鑒定為正品，樣品信息見表1；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；水為純化水，其他試劑均為分析純。

表1 天胡荽藥材樣品信息Tab.1 Information of Hydrocotyle sibthorpoides

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

參照《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范（2019 年版）》，并結(jié)合10 批天胡荽藥材樣品實際性狀，本品為不規(guī)則的段，根、莖、葉混合，偶見花與果實；根呈細(xì)圓柱形，表面為淡黃色或灰黃色；莖細(xì)而彎曲，黃綠色，節(jié)處有根痕或殘留細(xì)根；葉多皺縮或破碎，完整者展平后呈近圓性或腎性，葉片淺裂個數(shù)5～7 個，淺裂或裂至葉片中部，淡綠色；傘形花序??；雙懸果略呈心形，兩側(cè)扁平；氣香，味微苦。詳見圖1。

圖1 天胡荽藥材性狀Fig.1 Morphological character of Hydrocotyle sibthorpoides

2.2 鑒別

顯微鑒別：本品的莖橫切面，表皮細(xì)胞1列，外被角質(zhì)層，表皮下為1 列較整齊的厚壁組織，皮層薄壁細(xì)胞5～9 列；皮層可見分泌道；外韌型維管束5～6 個，排列成環(huán)，形成層不明顯；中央髓部為薄壁組織，常見分泌道。詳見圖2。

圖2 天胡荽藥材莖橫切面顯微特征Fig.2 Microscopic characters of stem transection of Hydrocotyle sibthorpoides

薄層色譜鑒別：取樣品粉末2 g，加70%乙醇20 mL和濃鹽酸2 mL，加熱回流2 h，濾過，取濾液，作為供試品溶液。取槲皮素對照品，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗，吸取10 批供試品溶液各5μL、對照品溶液2μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1，V/V/V）為展開劑，于相對濕度低于70%環(huán)境下展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點。詳見圖3。

圖3 天胡荽藥材薄層色譜圖（365 nm）S.Reference solution 1-10.Test solutionFig.3 TLC chromatogram of Hydrocotyle sibthorpoides（365 nm）

2.3 水分、灰分及酸不溶性灰分檢查

分別按2020年版《中國藥典（四部）》通則0832 水分測定法第二法（烘干法）、通則2302 總灰分測定法測定水分、總灰分和酸不溶性灰分的含量，結(jié)果10批天胡荽藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分的平均含量分別為9.0%，13.8%，4.2%，暫定天胡荽藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過11.0%，15.0%，4.0%。詳見表2。

表2 天胡荽藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物測定結(jié)果（%）Tab.2 Results of content determination of water，total ash，acidinsoluble ash and extract in Hydrocotyle sibthorpoides（%）

2.4 浸出物

按2020年版《中國藥典（四部）》通則2201 浸出物測定法測定浸出物的含量，結(jié)果天胡荽藥材中浸出物的平均含量為20.0%，暫定限度為不得少于16.0%。詳見表2。

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：360 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。此色譜條件下，供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)峰對主峰無干擾，槲皮素分離度大于1.5，峰對稱因子介于0.90～1.20，理論板數(shù)大于5 000，對照品溶液重復(fù)進樣5次的RSD不超過1.5%。詳見圖4。

圖4 高效液相色譜圖1.QuercetinA.Reference solution B.Test solutionFig.4 HPLC chromatograms

2.5.2 溶液制備

取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5μg 的對照品溶液。取樣品粉末（過3 號篩）1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，冷卻至室溫，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，加鹽酸3 mL，加熱回流30 min，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.5.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取槲皮素對照品0.010 16 g，置100 mL容量瓶中，用80%甲醇定容，制成質(zhì)量濃度為101.6μg/mL的對照品溶液，分別取0.1，0.2，0.5，0.8，1.0 mL，置10 mL 容量瓶中，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.016，2.032，5.080，8.128，10.160μg/mL的系列對照品溶液。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、槲皮素質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y= 0.665 4X+0.054（R2=0.999 9，n=5）。結(jié)果表明，槲皮素的質(zhì)量濃度在1.016～10.160μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取線性關(guān)系考察項下對照品溶液，按2.5.1項下色譜條件重復(fù)進樣測定5次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.20%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為THS - 07）適量，按2.5.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，20，24 h 時按2.5.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為3.92%（n= 7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取穩(wěn)定性試驗項下供試品溶液6 份，按2.5.1 項下色譜條件進樣測定，用回歸方程計算含量。結(jié)果平均含量為0.072 7%，RSD為1.75%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的天胡荽樣品（編號為THS-07）粗粉0.500 g，精密稱定，平行6 份，置100 mL具塞錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為3.612 mg/mL 的槲皮素對照品溶液100μL，按2.5.2項下方法制備供試品溶液，按2.5.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.5.4 樣品含量測定

取槲皮素對照品溶液及10批天胡荽藥材樣品的供試品溶液各適量，按2.5.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，分別按外標(biāo)法計算樣品中槲皮素的含量。結(jié)果10 批天胡荽藥材中槲皮素含量分別為0.072%，0.073%，0.076%，0.073%，0.097%，0.014%，0.053%，0.038%，0.089%，0.100%，平均為0.068%。以統(tǒng)計學(xué)方法分析含量數(shù)據(jù)，暫定限度為按干燥品計算，含槲皮素（C15H10O7）不得少于0.050%。

3 討論

3.1 浸出物檢查考察

按2020 年版《中國藥典（四部）》通則2201 浸出物測定法，考察了不同浸出方法（冷浸法、熱浸法）和不同溶劑（水、稀乙醇、70%乙醇、乙醇）對浸出物含量的影響，結(jié)果熱浸法的浸出物含量高于冷浸法，故選擇熱浸法作為提取方法。在熱浸法中用水、稀乙醇為溶劑時浸出物的含量相對更高，但用水提取很難過濾，故提取溶劑選擇稀乙醇。

3.2 薄層色譜條件考察

分別考察不同提取溶劑（乙醇30 mL、50%乙醇30 mL、70%乙醇30 mL 和濃鹽酸3 mL、70%乙醇20 mL 和濃鹽酸2 mL），不同提取方式（超聲提取、加熱回流提取），不同提取時間（1，2，3，4 h），不同點樣量（供試品溶液1，2，3，4，5，6μL，對照品溶液1，2μL），不同展開劑［環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶5∶0.8，V/V/V），甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1，V/V/V），甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10∶8∶1，V/V/V），甲苯- 乙酸乙酯- 甲酸（5∶4∶1，V/V/V）］，不同薄層板（硅膠H薄層板、聚丙烯酸鈉硅膠G薄層板、羧甲基纖維素鈉硅膠G薄層板）對槲皮素提取效果的影響，最終確定2.2 項下薄層色譜條件的提取效果較好，條帶較清晰，能滿足試驗要求。

3.3 含量測定供試品溶液制備方法考察

槲皮素可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等，參照《湖北省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2018年版）》、2020年版《中國藥典（一部）》中有關(guān)槲皮素含量測定方法及其他有關(guān)槲皮素含量測定的文獻，考察甲醇和鹽酸回流提取1 次及先用80%甲醇回流再用鹽酸水解回流提?。ɑ亓? 次，第2 次稀釋了2倍）對提取效果的影響，結(jié)果色譜峰無明顯差異，但回流提取2 次的峰面積普遍更大，可能是由于先用80%甲醇提取再用鹽酸水解，槲皮素提取更完全，故選擇提取2 次。采用L9（34）正交試驗考察取樣量（0.5，1.0，1.5 g），甲醇體積分?jǐn)?shù)（50%，80%，100%），回流時間（回流提取2 次，每次30 min，1 次1 h、1 次30 min，每次1 h），鹽酸體積（3，5，7 mL）對提取效果的影響，結(jié)果樣品取樣0.5 g，甲醇體積分?jǐn)?shù)80%，回流提取2 次，每次30 min，鹽酸體積3 mL 時的效果最佳。根據(jù)槲皮素含量與濃度相同的對照品峰面積相比，取樣0.5 g 時峰面積相對較小，為減小誤差，最終確定樣品取樣1.0 g。故確定2.5.2項下供試品溶液制備方法。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法可用于天胡荽藥材的質(zhì)量控制，暫定藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過11.0%，15.0%，4.0%，浸出物及槲皮素（C15H10O7）含量分別不得少于16.0%，0.050%。