基于網絡藥理學和細胞驗證探討甘草抗肺癌機制

張尚龍 ，閆瀟 ，楊秀娟 ，楊志軍 ，連小龍 ，張楠 ，葉禮巧 ，楊必乾 ，殷亭湄 ，付曉艷 ，馬趣環 ，鄧毅，

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

肺癌是全球發病率最高的惡性腫瘤之一，治療方法主要有手術治療、放射治療、化學治療、分子靶向治療等。由于肺癌早期癥狀不明顯，惡性程度較高，很多患者在確診時已發生腫瘤轉移和擴散，無法接受手術治療，故化療的作用不可替代。然而大劑量或重復低劑量化療藥物會引起較強的不良反應，且導致患者產生耐藥性。甘草具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥等功效[1]。藥理研究表明，甘草具有抗腫瘤、抗炎殺菌、抗病毒、保肝、抗心力衰竭、調節免疫及抗纖維化等作用[2]。近年來，甘草有效成分如甘草次酸、甘草苷、異甘草素等在抗肝癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌等腫瘤的研究取得了一定進展[3-7]。本研究采用網絡藥理學方法，對甘草抗肺癌作用進行靶點與通路篩選，并進行體外實驗驗證，為后續深入研究及新藥開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 甘草活性成分及靶點收集

通過TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件篩選甘草的活性成分及對應靶點；通過R語言軟件獲得靶點的縮寫名稱，構建中藥-化合物-靶點數據庫。

1.1.2 肺癌靶點收集

以“lung cancer”為關鍵詞，通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（http://https://omim.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com）數據庫檢索疾病靶點，檢索結果合并后去重，得到肺癌相關靶點。

1.1.3 甘草治療肺癌靶點收集

將甘草靶點與肺癌相關靶點通過微生信在線平臺（https://www.bioinformatics.com.cn/）可視化得到甘草-肺癌共有靶點，即為甘草治療肺癌的靶點。

1.1.4 蛋白相互作用網絡構建

將共有靶點導入STRING（https://string-db.org/）數據庫，在“organism”中選擇“Homo Sapiens”進行搜索，獲得蛋白相互作用（PPI）網絡，導出TSV格式文件，將其導入Cytoscape3.8.0（http://www.cytoscape.org/）軟件篩選關鍵靶點，繪制PPI網絡。

1.1.5 GO和KEGG通路富集分析

通過Metascape（http://metascape.org/）在線軟件對獲得的關鍵靶點進行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）。將分析結果前10條進行可視化。

1.1.6 共有靶點-化合物網絡構建

將共有靶點及化合物通過Cytoscape3.8.0軟件進行可視化，構建共有靶點-化合物網絡圖。

1.2 實驗驗證

1.2.1 藥物與細胞

甘草采自甘肅省金塔縣，經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。甘草提取物制備方法：稱取甘草粉末100 g，加50%乙醇（1∶10，W/V）浸提30 min，超聲提取（功率100 W，頻率60 kHz）30 min，真空抽濾后，減壓回收溶劑至50 mL，水浴加熱至干浸膏，快速研磨成細粉[8]，4 ℃冰箱保存，實驗時用DMEM高糖培養基配制成50 mg/mL母液。

人肺腺癌A549細胞，甘肅省腫瘤醫院惠贈。

1.2.2 試劑與儀器

DMEM高糖培養基（Cytiva公司，批號AH29027412），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號21030707），噻唑藍（MTT，北京索萊寶科技有限公司，批號917Q051），胰蛋白酶、青鏈霉素（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號GP2211017、GA22020011094），二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號1121E0331），兔抗β-actin、羊抗兔二抗（Abbkine公司，批號分別為ATVMA0302、ATVE16011），兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗HIF-1α及兔抗GLUT1（Abmart公司，批號分別為T40051、T40056、TA1009、T55360），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20211213）。

CO2恒溫培養箱（型號HF151，力康發展有限公司），酶標儀（型號RT-6100，深圳雷杜生命科學股份有限公司），電泳儀（型號DYY-6D，北京六一生物科技有限公司），超凈工作臺（型號B2HFsafe，上海力申科學有限公司），低溫冷凍離心機（型號H1650R，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），熒光倒置顯微鏡（型號MoticamPro2058，上海捷辰儀器有限公司）。

1.2.3 細胞培養

將凍存的A549細胞迅速解凍，加入完全培養基，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，轉移至培養瓶，加入5 mL配制好的完全培養液（10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液、89%高糖DEME培養基），輕輕吹打使細胞懸浮，轉移懸浮液至細胞培養瓶，置37 ℃、5%CO2培養箱進行培養，待培養瓶中細胞融合至80%～90%時，用胰酶消化并轉移至新的培養瓶中。

1.2.4 MTT法檢測細胞存活率

將細胞消化懸浮后以5×104個/mL接種于96孔板，待細胞貼壁生長24 h后，分為調零組（不加細胞和藥物）、對照組（不加藥物）及給藥組，每組3個復孔，給藥組用不同濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）甘草提取物處理24 h，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），4 h后加入150 μL DMSO，混勻，于酶標儀波長570 nm處檢測吸光度（OD值），計算細胞存活率。存活率（%）=（OD給藥組-OD調零組）÷（OD對照組-OD調零組）×100%。

1.2.5 Western blot檢測Bax、Bcl-2、HIF-1α、GLUT1蛋白表達

將A549細胞分為對照組和甘草低、中、高劑量組，以1×105個/mL接種于6孔板中，待其貼壁后，甘草低、中、高劑量組加入不同濃度（3、4、5 mg/mL）甘草提取物處理24 h，對照組加入不含藥物的培養基，收集細胞，于冰上加入細胞裂解液，分別提取總蛋白，加入上樣緩沖液，100 ℃金屬浴變性。根據分子量不同進行SDS-PAGE，轉PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入Bax、Bcl-2、HIF-1α、GLUT1一抗（均為1∶2 000），4 ℃孵育過夜，1×TBST清洗3次，每次10 min，加二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，1×TBST清洗3次，每次10 min，曝光顯影，用Image J軟件計算灰度值。

1.2.6 統計學方法

2 結果

2.1 甘草活性成分及靶點

通過TCMSP得到甘草化合物及靶點，刪去無靶點的化合物，最終得到甘草活性成分88個，靶點213個。

2.2 肺癌靶點

將GeneCards、OMIM、DrugBank數據庫收集到的肺癌靶點進行合并，刪除重復靶點，最終得到肺癌靶點23 458個。

2.3 甘草抗肺癌靶點

將檢索到的213個甘草活性成分的靶點與23 458個肺癌靶點比較分析后取重復值，得到共同作用靶點209個，作為甘草治療肺癌的潛在靶點。

2.4 核心靶點蛋白相互作用網絡

將209個潛在作用靶點導入STRING數據庫，獲得的PPI網絡導入Cytoscape3.8.0軟件進行分析，根據Degree值與中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality）高于平均值篩選出排名靠前的核心靶點43個。Degree值排序居前列的靶點有MAPK1、MAPK3、MMP2、MMP9、AKT1、VEGFA及HIF1A等。這些靶點主要參與細胞周期進程、細胞增殖、分化、侵襲、遷移、凋亡、細胞血管生成等過程。因此，蛋白質分子之間的相關性表明這些靶點可能是甘草對肺癌起到核心調控作用的靶點。見圖1。

圖1 甘草抗肺癌核心靶點PPI網絡

2.5 GO和KEGG通路富集分析結果

對甘草抗肺癌209個潛在靶點進行GO富集分析，共得到1 312條結果。其中BP 1 202條，主要涉及凋亡信號通路、細胞對脂質的反應、蛋白磷酸化的正調控等；CC 46條，主要涉及轉錄調節復合物、過氧化物酶體、囊泡腔、細胞器外膜等；MF 64條，主要涉及細胞因子受體結合、轉錄因子的結合、一氧化氮合酶的調節活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等。各前10條結果見圖2。

圖2 甘草抗肺癌潛在靶點GO富集分析

對甘草抗肺癌209個潛在靶點進行KEGG通路富集分析，共得到226條通路，主要涉及癌癥相關通路、動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、非酒精性脂肪肝、小細胞肺癌、幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號轉導等，前10條通路見圖3。Bcl-2家族是與細胞凋亡密切相關的一類蛋白，包括Bcl-2等凋亡抑制因子和Bax等促凋亡因子。甘草主要活性成分甘草查爾酮A[9]、甘草次酸[10]、異甘草素[11]等通過調節Bcl-2/Bax表達促進腫瘤細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用。HIF-1信號通路是缺氧微環境的關鍵通路，HIF-1α作為調節氧穩態的核轉錄因子，可調節70多個基因，如血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶等，調控惡性腫瘤的細胞增殖、血管生成、侵襲和轉移[12]。因此，推測甘草可能通過影響腫瘤細胞的凋亡通路及HIF-1α信號通路發揮抗腫瘤作用。

圖3 甘草抗肺癌潛在靶點KEGG通路富集分析

2.6 共有靶點-化合物網絡

甘草與肺癌共有靶點-化合物網絡見圖4。該網絡包含297個節點、1 495條邊。

圖4 甘草抗肺癌共有靶點-化合物網絡

2.7 實驗驗證結果

2.7.1 不同濃度甘草提取物對細胞存活率的影響

與對照組比較，1、2、3、4、5 mg/mL甘草提取物對A549細胞增殖均有抑制作用（P＜0.01），表明甘草對A549細胞存活率的影響有劑量依賴性。見表1。

表1 各組A549細胞存活率比較（，n=3）

表1 各組A549細胞存活率比較（，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01

存活率/%100.00±1.55 72.21±1.61**66.73±0.22**58.89±0.44**44.62±7.02**22.11±0.30**組別對照組給藥組濃度/（mg/mL）1 2 3 4 5

2.7.2 甘草對A549細胞Bax、Bcl-2、HIF-1α、GLUT1蛋白表達的影響

與對照組比較，甘草各劑量組Bcl-2、HIF-1α、GLUT1表達下調，Bax表達上調（P＜0.01），表明甘草對HIF-1α信號通路有抑制作用。見表2、圖5。

表2 各組A549細胞Bax、Bcl-2、HIF-1α和GLUT1蛋白表達比較（，/β-actin，n=3）

表2 各組A549細胞Bax、Bcl-2、HIF-1α和GLUT1蛋白表達比較（，/β-actin，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01

組別對照組甘草低劑量組甘草中劑量組甘草高劑量組GLUT1 1.39±0.05 0.96±0.02**0.57±0.06**0.30±0.06**濃度/（mg/mL）3 4 5 Bax 0.17±0.02 0.41±0.11**0.52±0.13**1.17±0.23**Bcl-2 1.44±0.07 0.69±0.04**0.52±0.08**0.23±0.07**HIF-1α 0.95±0.08 0.59±0.01**0.54±0.03**0.41±0.03**

圖5 各組A549細胞Bax、Bcl-2、HIF-1α和GLUT1蛋白免疫印跡

3 討論

目前肺癌治療以化療為主，而化療藥物的不良反應限制其臨床應用。甘草作為臨床常用藥物，可通過誘導細胞凋亡、干擾細胞周期、誘導自噬、抑制糖酵解、調節免疫、調控miRNA和多種信號通路等作用機制發揮抗腫瘤作用[2]。但甘草抗肺癌的作用機制尚未完全闡明。本研究通過網絡藥理學對甘草抗肺癌的機制進行研究，獲得88個藥物活性成分、209個潛在作用靶點，通過PPI網絡進一步分析獲得MAPK1、MAPK3、MMP2、MMP9及HIF1A等43個核心靶點。此外，通過對209個關鍵靶蛋白進行GO和KEGG通路富集分析，推測甘草活性成分靶點通過癌癥相關通路、HIF-1信號通路調控腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡。

本研究篩選出甘草提取物3、4、5 mg/mL 3種給藥濃度作用于人肺癌A549細胞，并選擇富集程度較高的HIF-1α信號通路進行驗證。與對照組比較，不同濃度甘草提取物均可抑制A549細胞增殖且具有濃度依賴性，甘草各劑量組能上調促凋亡蛋白Bax表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2、HIF-1α及GLUT1表達。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學及實驗驗證方法，對甘草抗肺癌機制進行研究，驗證了甘草抗肺癌多成分、多靶點、多途徑的作用特點，提示甘草抗肺癌的作用機制可能與抑制肺癌細胞增殖、促進細胞凋亡及調控HIF-1α信號通路有關，相關機制仍需體內實驗進一步驗證。本研究可為甘草的臨床應用及抗腫瘤新藥的開發提供依據。今后課題組將利用代謝組學及蛋白質組學等多種手段結合網絡藥理學對甘草抗肺癌的作用機制進行深入研究。