基于HSP27-TLR4/NF-κB通路的芪參顆粒對大鼠心肌梗死后炎癥反應的影響

于藜爽 ，郭淑貞 ，黃夢瑩 ，王曉平 ，張亞雯 ，洪藝勤 ，王勇 ，盧令慧

1.北京中醫藥大學中醫學院，北京 102488； 2.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 102488

心肌梗死是一種嚴重的心血管疾病，是心源性死亡的主要原因[1]。及時的血運重建和隨后的治療策略可顯著降低急性心肌梗死的病死率，但缺血性心臟病仍是心力衰竭的主要病因，遠期預后堪憂[2]。心肌梗死后心力衰竭的發生發展與炎癥反應等因素密切相關[2]。心肌梗死早期的炎癥反應是必要的、有益的，但炎癥反應失控則會加重心室不良重塑，導致重大不良臨床事件發生[3]。近年來，針對炎癥途徑和介質的抗炎治療策略在多項臨床試驗中取得了一定進展，同時指出，研究工作應著眼于多途徑抑制，以及靶向引發炎癥過程的上游介質[4]。

熱休克蛋白27（HSP27）是小型的HSP家族成員，在心臟中高表達，參與心臟相關的大量生理病理過程。多種刺激如氧化應激、細胞因子、炎癥因子等都可誘導HSP27表達從而增強耐受性[5]。臨床數據顯示，血液中HSP27表達在心力衰竭患者中顯著升高，是患者死亡或非計劃再入院的獨立預測因子[6]。細胞外HSP27可激活Toll樣受體（TLR）依賴的機制，進一步激活核因子-κB（NF-κB）通路，從而引發冠狀動脈內皮細胞炎癥反應，加速心肌缺血再灌注后心功能不全[7]。其中TLR4介導TLR4/NF-κB炎癥反應信號通路，通過調節心肌細胞氧化應激和凋亡[8]、心肌纖維化[9]等參與心肌梗死后心力衰竭相關病理進程。芪參顆粒是北京中醫藥大學王偉教授針對心力衰竭“虛”“毒”“瘀”的病機要點，以真武湯和四妙勇安湯為基礎化裁，全方具有益氣溫陽、活血解毒之功。課題組前期研究發現，芪參顆粒可以改善缺血心肌的氧化應激水平，減少促炎因子生成，抑制心室重構，改善心臟功能等[10-12]。本研究進一步探討其作用是否與調控血液HSP27含量、促進TLR4/NF-κB介導的炎癥反應有關。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠48只，體質量（200±10）g，斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養于（22±2）℃、濕度40%～60%環境，12 h明暗交替，自由進食飲水。本實驗經北京中醫藥大學倫理委員會審查批準（BUCM-4-2021110901-4044）。

1.2 藥物及制備

芪參顆粒（炙黃芪30 g，丹參15 g，玄參10 g，金銀花10 g，黑順片9 g，炙甘草6 g），飲片購自北京同仁堂股份有限公司。由中日友好醫院經水提、醇沉、干燥等工藝加工成凍干粉，出膏率為25.2%，低溫冷藏室密封保存。

1.3 主要試劑與儀器

HSP27檢測試劑盒（貨號SEA693Ra，武漢云克隆），NF-κB p65抗體（貨號ab16502，英國Abcam），TLR4抗體（貨號bs-20594R，北京博奧森），β-actin單克隆抗體（貨號HRP-66009，美國Proteintech），HRP標記二抗（貨號sc-2357，美國Santa Cruz），ECL PLUS超敏發光液（貨號P1050-100，北京普利萊）。ALC-V8S小動物呼吸機、Vevo2100小動物超聲影像系統，加拿大Visual Sonics；BSA224S電子分析天平，德國Sartorious；Pannoramic Scan掃描儀，匈牙利3DHISTECH；A009超分辨顯微組織成像系統，德國Leica；SpectraMax Paradigm多功能微孔讀板機，美國Molecular Devices；小型垂直電泳轉印系統，美國Bio-Rad；C600多功能激光熒光分子成像系統，美國Azure Biosystems。

1.4 分組、造模及給藥

48只大鼠適應性飼養1周后，進行左冠狀動脈前降支結扎術或假手術。手術方法參照前期操作[13]，1%戊巴比妥鈉麻醉，用16G靜脈留置針經口行氣管插管，連接呼吸機，潮氣量4.5～6 mL，心率80次/min，呼吸比1∶2。左前胸備皮，消毒，從3～4肋間隙逐層開胸，暴露心臟，于左心耳下1 mm處結扎左冠狀動脈前降支，結扎表面滴利多卡因預防室顫。逐層關胸，脫機，腹腔注射0.2 mL呋塞米，置保溫毯上蘇醒。假手術行相同開胸術，僅套線不結扎。術后24 h將存活假手術大鼠隨機分為對照組和芪參顆粒對照組，造模大鼠分為模型組和芪參顆粒組，芪參顆粒對照組和芪參顆粒組灌胃相當于人臨床等效劑量的芪參顆粒水溶液（2.352 g/kg），對照組和模型組予等體積蒸餾水，每日1次，連續1周。

1.5 指標檢測

1.5.1 超聲心動圖

給藥結束后，1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，備皮，行超聲心動分析。使用MS250探頭探查大鼠心臟短軸乳頭肌層面，分別采集大鼠B型及M型超聲心動圖動態影像。用Vevo2100軟件測量左室舒張末期前壁厚度（LVAWd）、左室收縮末期前壁厚度（LVAWs）、左室舒張末期內徑（LVIDd）、左室收縮末期內徑（LVIDs）、左室舒張末期后壁厚度（LVPWd）、左室收縮末期后壁厚度（LVPWs），每只大鼠測量3個心動周期，結果取平均值。系統自動計算射血分數（EF）、短軸縮短率（FS）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）。超聲操作與數據分析均以盲法進行。

1.5.2 心、肺臟器系數檢測

取材前稱量大鼠體質量（BM），麻醉后經腹主動脈采血，迅速摘取完整的心臟和肺臟，預冷PBS漂洗，排出心腔內殘留血液。心臟、肺臟置于冰盤上剔除多余組織，濾紙吸干表面水分，電子分析天平分別稱量心臟質量（HM）、肺臟質量（LM）。分離大鼠右下肢脛骨，剝離皮毛后用游標卡尺測量脛骨長度（TL），計算HM/BM、HM/TL、LM/BM、LM/TL，用于輔助評估心力衰竭和肺水腫程度。

1.5.3 心肌組織病理學檢測

心臟于結扎線下5 mm處橫向切開，取心底部置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片，進行麥胚凝集素（WGA）熒光染色、HE和Masson染色。用超分辨顯微組織成像系統掃描切片，用Caseviewer軟件觀察心肌結構、炎癥及纖維化改變。

1.5.4 ELISA檢測

使用EDTA抗凝管采集腹主動脈血，常溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書檢測HSP27含量。

1.5.5 Western blot檢測

取30 mg心肌組織，加RIPA裂解液（100 mg/mL）和研磨珠充分裂解，離心，取上清液，BCA法進行蛋白定量，加入loading buffer制備樣品，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒壓80 V），300 mA轉膜60 min；用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將膜分別放入TLR4一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶10 000），4 ℃過夜，TBST洗3次，每次5 min；加二抗（1∶7 500），室溫搖床孵育60 min，TBST洗3次，每次10 min，ECL發光液曝光顯影，Image J 6.0軟件測量灰度值，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 芪參顆粒對模型大鼠心功能的影響

與對照組比較，模型組大鼠LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、EF和FS顯著降低（P＜0.01），LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠LVAWs、LVPWd、EF和FS顯著升高，LVIDs、LVESV顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。芪參顆粒對照組與對照組比較，各指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 心功能指標各組大鼠比較（，每組7～10只）

表1 心功能指標各組大鼠比較（，每組7～10只）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

指標LVAWd/mm LVAWs/mm LVIDd/mm LVIDs/mm LVPWd/mm LVPWs/mm LVEDV/μL LVESV/μL EF/%FS/%芪參顆粒組1.78±0.62 2.50±0.91#6.86±1.09 4.42±1.22#2.28±0.32##2.97±0.39 251.26±93.48 97.13±53.59#62.15±17.11#35.99±13.68#對照組2.21±0.31 3.71±0.60 5.79±0.38 2.04±0.99 2.21±0.24 3.67±0.48 166.60±24.10 18.12±13.11 89.78±7.03 65.44±15.98芪參顆粒對照組2.01±0.37 3.87±0.40 6.17±0.92 1.97±0.93 2.03±0.23 3.41±0.25 196.83±65.24 16.64±14.94 92.81±5.36 69.31±11.61模型組1.39±0.53**1.57±0.63**7.68±1.06*5.89±1.05**1.80±0.16**2.87±0.43**320.97±102.05**178.81±77.21**45.59±5.64**23.61±3.25**

2.2 芪參顆粒對模型大鼠心、肺臟器系數的影響

各組大鼠HM/BM、HM/TL、LM/BM、LM/TL差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠臟器系數比較（）

表2 各組大鼠臟器系數比較（）

組別對照組芪參顆粒對照組模型組芪參顆粒組只數8 10 7 8 HM/BM（mg/g）3.38±0.35 3.21±0.28 3.33±0.27 3.43±0.24 HM/TL（mg/mm）17.84±1.04 18.03±2.81 17.71±1.97 17.79±0.68 LM/BM（mg/g）4.28±0.34 4.22±0.29 4.24±0.44 3.15±2.16 LM/TL（mg/mm）22.69±2.58 23.42±3.67 22.55±2.82 22.59±1.75

2.3 芪參顆粒對模型大鼠心肌組織病理變化的影響

WGA免疫熒光染色可標記細胞輪廓。結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌梗死邊緣區細胞橫截面積顯著增加，可能存在代償性肥大，芪參顆粒組梗死邊緣區細胞橫截面積較模型組顯著減少，見圖1。

HE染色結果顯示，對照組和芪參顆粒對照組大鼠心肌組織小動脈周圍心肌纖維排列整齊，形態正常；模型組大鼠心肌組織小動脈周圍有大量炎性細胞浸潤，心肌細胞死亡后被結締組織填充，殘存心肌細胞代償性肥大；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠心肌組織炎性細胞浸潤和心肌細胞存活情況顯著改善。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織形態（HE染色，標尺=40 μm）

Masson染色結果顯示，對照組和芪參顆粒對照組大鼠心肌間質僅有極少量藍染的膠原纖維，而模型組大鼠心肌梗死邊緣區心肌間質內可見大量藍色膠原纖維；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠心肌梗死邊緣區心肌間質纖維化情況顯著改善。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織形態（Masson染色，標尺=200 μm）

2.4 芪參顆粒對模型大鼠血漿熱休克蛋白27含量的影響

與對照組比較，芪參顆粒對照組大鼠血漿HSP27含量差異無統計學意義（P＞0.05），模型組大鼠血漿HSP27含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠血漿HSP27含量顯著減少（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血漿HSP27含量比較（，ng/mL）

表3 各組大鼠血漿HSP27含量比較（，ng/mL）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

HSP27 45.57±1.37 44.53±1.21 48.20±1.26**45.27±0.78##組別對照組芪參顆粒對照組模型組芪參顆粒組只數6 6 6 6

2.5 芪參顆粒對模型大鼠心肌組織Toll樣受體4、核因子-κB p65蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。見圖4、表4。

圖4 各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達比較（）

表4 各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

NF-κB p65 1.00±0.19 0.87±0.32*1.47±0.15#0.93±0.27*組別對照組芪參顆粒對照組模型組芪參顆粒組只數3 3 3 3 TLR4 1.00±0.29 0.76±0.07*1.84±0.54#0.99±0.25*

3 討論

心肌梗死屬中醫學“胸痹”“真心痛”范疇。中醫學認為，在心肌梗死發展至心力衰竭的過程中，氣虛血瘀是基本病機，陰陽失調是疾病發展的基礎，痰飲水停是疾病發展的病理產物[14]。芪參顆粒由炙黃芪、黑附片、丹參、玄參、金銀花、炙甘草組成，具有益氣溫陽、活血解毒功效。臨床研究顯示，芪參顆粒治療慢性心力衰竭安全有效，可降低N-末端腦鈉肽前體，改善患者心功能分級，減輕心力衰竭癥狀等[15]。基礎研究發現，芪參顆粒可降低炎癥因子水平，從而改善心臟功能[16]。本研究通過超聲評價大鼠心功能、病理染色觀察心臟結構，發現芪參顆粒可以改善心肌梗死大鼠早期收縮功能下降和梗死邊緣區心肌細胞代償性肥大，減輕小動脈及肌纖維間質炎性細胞浸潤和纖維化程度。

HSP27在心肌細胞中高表達，盡管細胞內的HSP27被認為是增強應激耐受從而發揮保護作用的重要分子，但心肌損傷時HSP27會從心肌細胞釋放入血，目前尚不明確其釋放機制是主動分泌還是被動滲漏。血液HSP27水平升高與心肌梗死后心力衰竭關系密切，研究發現，HSP27水平與左心室收縮、舒張功能呈負相關，與LVIDd、紐約心臟病協會分級、N-末端腦鈉肽前體水平呈正相關[17-18]。除與心肌損傷程度相關外，血漿HSP27水平還與心血管疾病預后密切相關，且已經成為慢性心力衰竭患者預后、死亡或非計劃再入院的獨立預測因子[6]。

有研究表明，人和小鼠心肌細胞響應缺血應激后釋放HSP27，而細胞外HSP27作為一種炎癥介質主要通過激活TLR4/NF-κB通路誘導心臟和血管炎癥反應，從而加速心肌損傷[7]。TLR4/NF-κB信號通路是一種與炎癥免疫密切相關的轉導通路，在組織炎癥的發生發展中起重要作用。TLR4是模式識別受體家族的成員，可識別病原體相關分子，激活NF-κB等轉錄因子，啟動多種促炎細胞因子表達，如白細胞介素-1、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等，持續加重心肌炎癥反應[19]。靶向TLR4抗炎成為延緩心力衰竭進展的新策略，如臨床常用抗心力衰竭藥物卡維地洛可抑制TLR4介導的心肌炎癥[20]。TLR4/NF-κB通路還可調節上游炎癥，從而成為炎癥調節的樞紐和關鍵因素。炎癥持續增強會擴大梗死面積、降低心肌收縮力、減少心輸出量，加速心室重構及心力衰竭進展[21]。本研究通過ELISA檢測發現，模型組大鼠血漿HSP27含量增加，心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達升高，提示該炎癥通路被激活，可能介導持續的炎癥反應，加重心肌損傷；芪參顆粒可明顯降低模型大鼠血漿HSP27水平，下調心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達，提示芪參顆粒可有效減少心肌HSP27釋放，阻斷由其介導的TLR4/NF-κB炎性信號通路的激活，這可能是芪參顆粒發揮心肌保護作用的機制之一。另外芪參顆粒對照組結果顯示，芪參顆粒亦可顯著降低正常大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達，不排除芪參顆粒直接下調該通路發揮抗炎作用，顯示了中藥復方多靶點協同增效的特性。

綜上，芪參顆粒可下調心肌梗死大鼠血漿HSP27含量，進而抑制TLR4/NF-κB通路介導的心肌梗死早期炎癥反應，減輕梗死邊緣炎性細胞浸潤、心肌細胞代償性肥大和心肌間質纖維化等病理改變，進而改善心臟結構和收縮功能。