益氣解毒化瘀方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

查瑞瑤，李明，汪悅

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是消化系統(tǒng)難治性疾病，好發(fā)于腸道黏膜層及黏膜下層，屬于炎癥性腸病范疇[1-2]，臨床癥狀主要有腹痛、腹瀉及黏液膿血便。研究發(fā)現(xiàn)，UC發(fā)病機(jī)制可能與免疫紊亂、凝血功能異常、腸黏膜屏障受損、腸道微生態(tài)改變等有關(guān)[3]。JAK2/STAT3信號(hào)通路是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4]，與UC發(fā)病密切相關(guān)。研究顯示，UC細(xì)胞因子可能通過介導(dǎo)JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)控T細(xì)胞分化，導(dǎo)致下游炎性因子“瀑布樣釋放”，進(jìn)而損傷腸黏膜[5]。

益氣解毒化瘀方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科在多年臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上總結(jié)出的治療UC有效方，認(rèn)為UC發(fā)病以脾氣虛弱為本，濕熱內(nèi)蘊(yùn)為標(biāo)，局部可能呈現(xiàn)血瘀的臨床證變，故應(yīng)用益氣解毒化瘀為主要治法治療UC，療效顯著[6]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，益氣解毒化瘀方對(duì)UC大鼠免疫機(jī)制有調(diào)節(jié)作用，可降低UC大鼠炎癥因子水平，修復(fù)腸黏膜屏障[7]。本研究從JAK2/STAT3信號(hào)通路出發(fā)，進(jìn)一步研究益氣解毒化瘀方調(diào)節(jié)UC大鼠免疫機(jī)制的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療UC提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性大鼠60只，5～6月齡，體質(zhì)量180～220 g，安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（皖）2017-001。飼養(yǎng)于溫度22～28 ℃、相對(duì)濕度50%～60%環(huán)境，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批（AHUCM-2022066）。

1.2 藥物及制備

益氣解毒化瘀方由黨參10 g、赤芍10 g、白芍10 g、煨木香10 g、薏苡仁30 g、白及10 g、麩炒白術(shù)10 g、三七粉5 g、馬齒莧15 g、炒谷芽15 g、黃連2 g、黃柏10 g組成。飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，除三七粉外，所有飲片常規(guī)浸泡、煎煮、過濾，藥液加入三七粉混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成每毫升含3 g原藥材藥液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ沁拎て?.25 g/片，批號(hào)20160702，上海三維制藥有限公司。使用時(shí)去除外層包衣，研為細(xì)粉，用蒸餾水配制成40 mg/mL混懸液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

5% 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，批號(hào)P5632），德國Sigma公司；95%乙醇（批號(hào)100603），上海彤最化工科技有限公司；BSA（批號(hào)A602440-0050），生工生物工程（上海）股份有限公司；白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-23、IL-17 ELISA試劑盒（批號(hào)均為20170312），安徽巧伊生物科技有限公司；維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt（RORγt）抗體（貨號(hào)bs-10647R）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）抗體（貨號(hào)bsm-33218M）、IL-6抗體（bs-0782R）、p-STAT3抗體（bs-1658R）、JAK2抗體（bs-23003R），北京博奧森；RIPA細(xì)胞裂解液（貨號(hào)P0013B），上海碧云天；PVDF膜（貨號(hào)IPVH00010），美國Millipore；PAGE膠促凝劑（貨號(hào)T8090），北京Solarbio。自動(dòng)曝光儀（型號(hào)JS-1070P，上海培清科技有限公司），轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)VE-186，上海天能科技有限公司），常溫微量離心機(jī)（型號(hào)LX 300，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），倒置顯微鏡（型號(hào)TS100-F，日本Nikon），酶標(biāo)儀（型號(hào)iMark Microplate Reader，美國Bio-Rad）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

60只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組和益氣解毒化瘀方低、中、高劑量組，每組10只。造模前大鼠禁食不禁水24 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將直徑約1.5 mm的聚丙烯管插入肛門上端約8 cm，將TNBS原液0.2 mL/100 g加50%乙醇0.25 mL[8-9]，緩慢注入腸腔，提起大鼠尾部，倒置約30 s使造模劑充分接觸腸腔。空白組予等體積生理鹽水。造模第3日大鼠出現(xiàn)進(jìn)食量減少、豎毛、懶動(dòng)、黏液血便等表現(xiàn)，表明造模成功，剖腹摘取直腸和結(jié)腸，清洗后肉眼觀察結(jié)腸水腫情況。

造模第4日開始給藥，根據(jù)人與動(dòng)物等效劑量換算法及前期經(jīng)驗(yàn)[9-10]，益氣解毒化瘀方低、中、高劑量組分別按人等效劑量的0.5、1、2倍灌胃益氣解毒化瘀方藥液（6.85、13.7、27.4 g/kg），柳氮磺吡啶組按0.4 g/kg灌胃，體積1 mL/100 g，正常組及模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)2周。

2.2 標(biāo)本采集

末次給藥24 h后，脫頸椎法處死大鼠，腹主動(dòng)脈采血，用于ELISA檢測(cè)。取肛門至盲腸部結(jié)腸（約8 cm），沿腸系膜縱軸剪開，用冷生理鹽水沖洗干凈后平展于濾紙上，一部分用10%甲醛溶液固定，進(jìn)行HE染色；剩余組織迅速置于離心管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測(cè)。

2.3 結(jié)腸組織形態(tài)觀察

結(jié)腸組織用10%甲醛溶液固定后，常規(guī)脫水，浸蠟，透明，包埋，4 μm厚度切片，進(jìn)行HE染色后觀察結(jié)腸組織病理變化。

2.4 ELISA檢測(cè)

取血后靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒測(cè)定IL-6、IL-23、IL-17含量，嚴(yán)格按說明書步驟操作。

2.5 Western blot檢測(cè)

結(jié)腸組織用勻漿機(jī)破碎，加入裂解液提取總蛋白，使用10%分離膠進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，加入IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜5次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液，37 ℃孵育1～2 h，加入ECL發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器中曝光，以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件測(cè)量蛋白相對(duì)灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 益氣解毒化瘀方對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

空白組大鼠腸黏膜形態(tài)正常，無充血、水腫、糜爛、潰瘍；模型組大鼠結(jié)腸黏膜可見潰瘍形成，有大量炎性細(xì)胞和壞死細(xì)胞碎片，并伴有出血，累及黏膜下層，局部黏膜壞死，腺體結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂；與模型組比較，各給藥組炎性細(xì)胞浸潤程度有所減輕，隱窩結(jié)構(gòu)改變有所緩解，益氣解毒化瘀方中、高劑量組和柳氮磺吡啶組改善效果更為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.2 益氣解毒化瘀方對(duì)模型大鼠血清白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-17、白細(xì)胞介素-23含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23含量均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，益氣解毒化瘀方中、高劑量組和柳氮磺吡啶組IL-6、IL-17含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），IL-23含量有所減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23含量比較（，每組6只）

4.3 益氣解毒化瘀方對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-6、Janus激酶2、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3、維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，益氣解毒化瘀方中、高劑量組和柳氮磺吡啶組大鼠結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)比較（，每組6只）

5 討論

JAK/STAT是一條由細(xì)胞因子刺激的多效級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路，不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，且在免疫系統(tǒng)發(fā)育和應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Janus激酶（JAK）是一種酪氨酸蛋白激酶，目前發(fā)現(xiàn)JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2（Tyk2）共4個(gè)成員。STAT是一類能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的胞質(zhì)蛋白家族，是JAK家族的直接下游底物[11-13]。STAT3位于IL-6通路下游，對(duì)Th17細(xì)胞的生成、分化至關(guān)重要。Th17細(xì)胞是CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的新亞型，可介導(dǎo)慢性炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生，主要分泌IL-17、IL-21和IL-22等炎癥因子[14-16]。Th17細(xì)胞的早期分化主要受轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）和IL-6的協(xié)同誘導(dǎo)，而已分化的Th17細(xì)胞存活及增殖則需IL-23刺激來維持，IL-23主要通過介導(dǎo)JAK/STAT信號(hào)通路上調(diào)IL-6等炎癥因子表達(dá)，參與維持Th17細(xì)胞存活及增殖[17-19]。RORγt是控制Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)編碼IL-17細(xì)胞因子基因表達(dá)[20]。

JAK/STAT信號(hào)通路除在細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要作用外，還與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[21-23]。當(dāng)腸道上皮細(xì)胞受到外界因子刺激時(shí)，前炎癥因子刺激樹突狀細(xì)胞成熟并產(chǎn)生炎癥因子如IL-6、IL-23等，炎癥因子進(jìn)一步與相應(yīng)受體結(jié)合，導(dǎo)致受體發(fā)生二聚化或多聚化，使JAK1、JAK2磷酸化并激活STAT3，p-STAT3可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，產(chǎn)生IL-17、IL-21、IL-22等，從而上調(diào)炎癥因子水平，誘導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致UC[24-26]。

益氣解毒化瘀方由白頭翁湯和芍藥湯化裁而來，對(duì)UC具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。方中黨參、麩炒白術(shù)、薏苡仁健脾益氣，赤芍、白芍養(yǎng)血調(diào)血、柔肝止痛，三七、白及活血化瘀、止血去瘀，促進(jìn)潰瘍面愈合，馬齒莧為治痢之良藥，兼具清熱解毒涼血之功，煨木香、黃連、黃芩共奏清熱解毒、理氣調(diào)中之功，炒谷芽調(diào)和諸藥。全方具有益氣健脾、活血化瘀、清熱涼血解毒功效。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23水平升高，結(jié)腸黏膜可見潰瘍、出血及壞死，益氣解毒化瘀方可降低UC大鼠血清IL-6、IL-17水平，改善結(jié)腸黏膜損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)顯著升高，表明Th17細(xì)胞分化增多，產(chǎn)生大量炎癥因子。經(jīng)益氣解毒化瘀方干預(yù)后，模型大鼠結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表達(dá)降低，說明JAK2/STAT3信號(hào)通路被抑制，炎癥因子生成減少，炎癥反應(yīng)減輕，從而發(fā)揮治療UC的作用。

綜上，益氣解毒化瘀方可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路，降低炎癥因子水平，減輕免疫炎癥反應(yīng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究可為中醫(yī)藥治療UC提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。