青島近海球形棕囊藻的宏條形碼分析*

王一奇 丁翔翔 宋會銀 陳楠生

(1.中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室 山東青島 266071; 2.嶗山實驗室 海洋生態與環境科學功能實驗室 山東青島 266237; 3.中國科學院海洋大科學研究中心 山東青島 266071; 4.中國科學院大學 北京 100049; 5.江漢大學 湖北武漢 430056)

隸屬于定鞭藻門(Haptophyta) 的棕囊藻屬(PhaeocystisLagerheim)物種在包括極地和溫帶海域在內的全球海域廣泛分布, 既是重要的初級生產者,也是構成海洋生態系統的基礎, 為浮游動物提供食物(齊雨藻等, 2001)。棕囊藻屬物種具有重要的生態功能, 不僅能夠合成和降解二甲基巰基丙酸(DMSP),釋放二甲基硫(DMS)在氣候調節中起重要作用(沈萍萍等, 2018), 而且可以引起赤潮, 在包括歐洲北海沿岸海域、荷蘭沿海、挪威海等海域頻繁暴發, 產生灰白色泡沫, 給海洋環境和漁業造成極大危害(齊雨藻等, 2002)。自1997 年10 月球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)赤潮首次在我國東南沿海海域大規模暴發以來, 球形棕囊藻赤潮在包括福建、廣東、廣西、海南、河北及天津等省市海域在內的多個海域都頻繁暴發(Wanget al, 2021)。

由于球形棕囊藻具有復雜的異型生活周期(heteromorphic life cycle), 既包括游離具有鞭毛的單細胞形態, 也具有囊體形態, 不同形態具有不同的生理和生態特征(Rousseauet al, 2007; Wanget al, 2021),加上球形棕囊藻細胞很小(直徑約3～9 μm), 增加了基于形態特征的檢測和鑒定的難度。1997 年球形棕囊藻赤潮首次在我國海域暴發時, 曾經根據其形態特征鑒定為波切棕囊藻(Phaeocystis pouchetii) (何家菀等, 1999), 后來通過分子生物學方法確認為球形棕囊藻(王寧等, 2000), 表明分子生物學方法的輔助鑒定大大提升了鑒定的敏感性和準確性。在球形棕囊藻赤潮首次在我國海域暴發時, 赤潮原因種曾被鑒定為一個新紀錄種(陳菊芳等, 1999)。不過由于其細胞小,在浮游植物調查研究中可能被忽視, 因此并不能排除它本來就是我國海域的一個常見物種, 只是長期沒有得到準確鑒定。

基于通用分子標記擴增子高通量測序的宏條形碼分析(metabarcoding analysis)越來越廣泛地應用于鑒定特定海洋生態環境中浮游植物的組成并跟蹤浮游植物的時空動態變化(陳楠生, 2020)。與其他種類分子標記相比, 針對海洋浮游植物和赤潮物種的宏條形碼分析中應用最多的分子標記18S rDNA V4 具有較高的分辨率, 其長度(～380 bp)也適于DNA 二代測序技術, 而且參考序列最豐富(Guillouet al, 2013)。不過, 由于包括球形棕囊藻在內的定鞭藻物種的18S rDNA 均具有較高的GC 含量, 使得基于不同引物的PCR 擴增結果出現了不利于定鞭藻物種的擴增偏好性, 導致宏條形碼分析容易遺漏掉大量的定鞭藻物種(Liuet al, 2009)。這些研究表明擴增引物的選擇對針對定鞭藻物種的宏條形碼分析的重要性。為了評估18S rDNA V4 不同擴增引物對球形棕囊藻宏條形碼分析結果的影響, 我們利用青島棧橋海域的水樣, 比較分析了18S rDNA V4 擴增引物對宏條形碼分析結果的影響。本研究比較分析了18S rDNA V4 兩組常用擴增引物: (1) 由Stoeck 等開發的擴增引物(簡稱Stoeck 引物), 包括 V4F: CCAGCA(G/C)C(C/T)GCGGTAATTCC 和V4R: ACTTTCGTTCTTGAT(C/T)(A/G)A (Stoecket al, 2010; Liuet al, 2021); (2) 由宋倫等開發的擴增引物(簡稱Song 引物), 包括V4-F:GCGGTAATTCCAGCTCCAAT 和V4-R: GATCCCC HWACTTTCGTTCTTGA(宋倫等, 2016)。除此之外,還比較分析了2021 年冬季青島近岸海域(西海岸)首次暴發的球形棕囊藻赤潮(Liet al, 2022; Songet al,2022; 張清春等, 2022)樣本的球形棕囊藻及其時間動態變化。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

為了比較分析通用分子標記18S rDNA V4 的擴增引物選擇對針對球形棕囊藻的宏條形碼分析結果的影響, 我們在青島棧橋海域系統開展了時間序列的采樣。從2021 年9 月1 日至30 日, 于青島棧橋定點(圖1)完成了30 天不間斷的連續逐日采樣。采集時間為每天上午10 點, 每次采集表層海水5 L, 采用200 μm 篩絹于現場完成藻細胞過濾, 去掉大型的浮游動物和浮游植物, 保留藻細胞樣本, 帶回實驗室進行第2 次過濾, 采用0.2 μm 的聚碳酸酯膜(Millipore,USA) 對1.5 L 海水進行過濾, 攜帶藻細胞的濾膜迅速放入液氮罐中冷凍保存。除了采集藻細胞, 還于現場完成了溫度和鹽度的測量, 并于實驗室完成了對海水樣本進行葉綠素和營養鹽測量(附表1)。

圖1 本研究采樣位點示意圖Fig.1 Locations of sampling sites in this study

青島近海于2021 年冬季(12 月)突然暴發了一次球形棕囊藻赤潮, 我們對此赤潮事件也進行了時間序列的采樣。采樣站位位于青島魯海豐海洋牧場(圖1),共完成了7 次采樣, 包括12 月3 日、12 月8 日、12月11 日、12 月16 日、12 月21 日、12 月26 日和12月31 日采樣。赤潮暴發期間, 海水中的球形棕囊藻囊體很多, 肉眼可見(附圖1), 最后一次采集樣品時肉眼可見的囊體很少且沒有完整的形態。每次采集1.5 L 表層海水, 為避免過濾掉囊體, 現場直接采集表層海水, 未經篩娟過濾, 后續的采樣流程與青島棧橋海域時間序列的采樣流程相同。

1.2 DNA 提取、PCR 擴增與測序

濾膜細胞的DNA 提取方法參照文獻(Liuet al,2020)。為了比較由于引物選擇對分子標記18S rDNA V4 擴增結果的影響, 分別利用Stoeck 引物和Song 引物對棧橋海域樣本的DNA 進行了擴增。

針對西海岸赤潮海域樣本, 利用Song 引物進行了擴增。

擴增結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物的長度, 檢測合格后將產物送至北京諾禾致源科技股份有限公司, 使用 Illumina 公司 TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫的構建, 構建好的文庫經過Qubit 定量和文庫檢測, 合格后, 使用NovaSeq 6000 PE250 模式進行上機測序。

1.3 生物信息學分析

利用R 包DADA2 對擴增子測序結果展開宏條形碼分析(Callahanet al, 2016, 2017), 分析參數設置如下: maxEE = c (2,2), minLen = 200, truncLen = c(220,220), minBoot = 80, and Min overlap = 12。運行得到ASV 豐度信息以及各個ASV 的PR2注釋結果。為保證各樣本測序深度的可比性, 使用R 包Vegan(Dixon, 2003)按照ASV 豐度表格中樣本的最低數據量抽平, 并采用0.01%的閾值進行豐度篩選。接著對各個ASV 進行進一步的blastn 注釋, 設置PID 大于99%, Coverage 大于95%, 合并PR2注釋結果和blastn注釋結果。通過Mega 11.0 軟件的最大似然法構建了ASV 和代表序列之間的遺傳進化樹(Tamuraet al,2021), Bootstrap 值為1 000。各ASV 之間的TCS 遺傳網絡圖是借助PopART v1.7 構建的(Leighet al,2015)。利用R 包corrplot (Weiet al, 2017)和psych(Revelle, 2021)完成了ASV 與環境因子的相關性分析。利用R 包Vegan (Dixon, 2003)完成了對測序數據的稀釋曲線分析。

1.4 基于18S rDNA V4 的遺傳多樣性分析

把從宏條形碼分析結果中篩選出注釋為球形棕囊藻的18S rDNA V4 ASV 序列, 以及從不同海域分離到的代表性球形棕囊藻株系的18S rDNA V4 序列一起構建系統發育樹。這些代表性球形棕囊藻株系包括: CNS00062(北部灣)、CNS00063(北部灣)、CNS00069(北部灣)、CNS00073(北部灣)、CNS00076(北部灣)、CNS00082(越南)、CNS00093(越南)、CNS00254(越南)、CNS00079(泰國)、CNS01609(青島西海岸赤潮暴發海域)和Pg-G(A) (歐洲北海)。

2 結果

2.1 評估18S rDNA V4 擴增引物對球形棕囊藻宏條形碼分析結果的影響

本研究中, 每一個樣本的18S rDNA V4 擴增子通過二代測序獲得約5 萬條reads (圖2)。稀釋曲線分析(附圖2a, 2b)表明測序深度基本達到飽和, 足夠用于分析樣本中浮游植物的組成。通過對不同擴增引物(Stoeck 引物和Song 引物)獲得的測序結果進行宏條形碼分析, 獲得了綠藻, 隱藻, 甲藻, 定鞭藻等浮游植物門的組成信息(圖2)。利用Stoeck 引物(Stoecket al, 2010; Liuet al, 2021)的擴增結果開展宏條形碼分析獲得的甲藻門(Dinoflagellata)、棕鞭藻門(Ochrophyta,包 括 硅 藻) 、 定 鞭 藻 門(Haptophyta) 、 綠 藻 門(Chlorophyta)和隱藻門(Cryptophyta)的ASV(amplicon sequence variant, 擴增子序列變異)數目分別為479、244、0、43 和21 個; 利用Song 引物(宋倫等, 2016)的擴增結果開展宏條形碼分析獲得的甲藻門、棕鞭藻門、定鞭藻門、綠藻門和隱藻門分別為581、293、76、49 和26 個。比較兩種引物的分析結果發現差異主要體現在定鞭藻門上, 利用Stoeck 引物的宏條形碼分析沒有發現任何鑒定為定鞭藻門的ASV, 而利用Song 引物的宏條形碼分析發現了76 個鑒定為定鞭藻門的ASVs (圖3a, 3c)。因此, Song 引物能夠更好地實現對18S rDNA V4 的擴增, 從而能夠更好地擴增出定鞭藻物種, 更適于針對定鞭藻的宏條形碼分析。

圖2 棧橋海域樣本的宏條形碼分析流程Fig.2 Metabarcoding analysis of the samples collected in Zhanqiao Pier, Qingdao

2.2 宏條形碼分析可以成功鑒定球形棕囊藻并且能夠鑒定球形棕囊藻的遺傳多樣性

通過對青島棧橋海域的30 個逐日樣本的宏條形碼分析得到的全部ASVs 進行物種注釋, (圖4a)發現了兩個ASVs (ASV_2 和ASV_6)注釋為球形棕囊藻,這兩個ASVs 可能代表兩個球形棕囊藻株系。這兩個ASVs 在所有30 個棧橋海域樣本中都出現了(圖5d, 5e,5f), 并且具有相對穩定的水平, 表明青島海域中存在球形棕囊藻, 并且存在一定的遺傳多樣性, 是青島近海的本地株系。本研究表明Song 引物不僅可以成功擴增球形棕囊藻的18S rDNA V4, 并且擴增結果可以揭示球形棕囊藻的遺傳多樣性。

圖4 球形棕囊藻ASVs 之間的遺傳多樣性及其與環境因子相關性分析Fig.4 TCS network display of ASVs annotated as P. globosa and their correlation with environmental factors

利用Song 引物對青島近海2021 年冬季(12 月)突發性球形棕囊藻赤潮暴發期間采集的時間序列樣本的宏條形碼分析也發現了這兩個ASVs 的信息, 并且比較分析發現兩種ASVs 的相對豐度顯示出不同的時間變化規律(圖5)。在從青島西海岸球形棕囊藻赤潮暴發過程中采集到的樣本中, ASV_2 代表的球形棕囊藻株系在赤潮暴發高潮期間的相對豐度較高, 并在赤潮暴發過程中顯示出較強的豐度變化, 隨著赤潮的消退逐步降低(圖5a)。與ASV_2 代表的株系相比, ASV_6 代表的球形棕囊藻株系的相對豐度較低,并在赤潮暴發過程中顯示出較弱的豐度變化, 基本維持在接近本底的水平(圖5b)。此外, 在球形棕囊藻赤潮暴發高峰時ASV_2 的豐度也高于ASV_ 6(圖5c)。這說明以ASV_2 和ASV_6 為代表的兩類球形棕囊藻在西海岸赤潮暴發中扮演著不同的角色: 以 ASV_2 為代表的球形棕囊藻隨著西海岸赤潮暴發呈現出先增加后減少的趨勢, 且在西海岸赤潮起主要作用, 而以 ASV_6 為代表的球形棕囊藻變化較小。ASV_2 和ASV_6 與青島海域的環境因子的相關性分析(圖4b)表明, 與ASV_6 相比, ASV_2 與海水溫度呈顯著負相關(P<0.01), 說明ASV_2 代表的是一類耐低溫的球形棕囊藻株系, 在環境條件適宜時造成此次赤潮暴發。

2.3 基于18S rDNA V4 的球形棕囊藻遺傳多樣性分析

前期的研究表明球形棕囊藻具有較高的遺傳多樣性(Songet al, 2020, 2021, 2022; Wanget al, 2021)。為了探索本研究中發現的ASV_2 和ASV_6 所代表的球形棕囊藻與前期報道的球形棕囊藻的遺傳多樣性之間的關系, 我們將ASV_2 和ASV_6 序列與11 株從不同海域分離的球形棕囊藻株系的18S rDNA V4序列進行了遺傳進化分析(圖6)。發現這些18S rDNA V4 序列可以聚成兩個不同的分支, 球形棕囊藻代表性株系的18S rDNA V4 序列要么與ASV_2 聚在一起,要么與ASV_6 聚在一起(圖6), 表明根據18S rDNA V4 可以將球形棕囊藻株系區分為兩類。此外, ASV_2序列還與CNS01609 株系(在青島西海岸赤潮暴發海域分離)聚在一起。本研究表明, 宏條形碼分析中常用的通用分子標記(即可以用于擴增廣譜性物種)18S rDNA V4 不僅可以鑒定到球形棕囊藻, 還可以用于初步區分球形棕囊藻的遺傳差異。

圖6 基于通用分子標記18S rDNA V4 序列的遺傳進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of the common molecular marker 18S rDNA V4

3 討論

3.1 通用分子標記18S rDNA V4 的PCR 擴增引物選擇對宏條形碼分析結果的準確性很重要

通過比較針對分子標記18S rDNA V4 的兩套不同PCR 擴增引物(即Stoeck 引物和Song 引物)發現,這兩套針對18S rDNA V4 的擴增引物得到的宏條形碼分析結果顯示出巨大不同。盡管基于兩套引物的宏條形碼分析均鑒定出大部分門類的浮游植物組成,包括甲藻、棕鞭藻、綠藻和隱藻(圖3)。然而只有基于Song 引物的宏條形碼分析獲得了定鞭藻信息(76個ASVs), 基于Stoeck 引物的宏條形碼分析沒有檢測到任何定鞭藻信息。本研究結果與宋倫等(2016)的分析結果基本相符。此外, 本研究結果進一步明確了18S rDNA V4 擴增引物的選擇對研究結果的準確性很重要。

3.2 青島近岸海域存在當地球形棕囊藻株系

本研究發現在青島近岸海域中可以鑒定到球形棕囊藻信息, 并且該分子生物學鑒定結果與形態學鑒定結果(附圖1)相符, 因球形棕囊藻單細胞尺寸很小, 分子生物學的快速鑒定顯示出方法的優勢。此外,針對野外樣本的宏條形碼分析得到的球形棕囊藻序列ASV_2 與2021 年冬季青島西海岸球形棕囊藻赤潮暴發海域分離到的球形棕囊藻株系CNS01609 的18S rDNA V4 序列完全一致(圖6), 進一步證實青島近岸海域存在本底球形棕囊藻株系。不僅如此, 經分子生物學鑒定分析發現在青島棧橋海域和西海岸赤潮暴發海域中均出現了兩類不同的球形棕囊藻株系(即由ASV_2 和ASV_6 代表的兩類株系)。ASV_2 和ASV_6在2021 年9 月棧橋海域的整月采樣過程中相對比較穩定, 沒有受到潮汐的顯著影響(圖5)。利用 18S rDNA V4 (Liuet al, 2020)針對2019 年1 月膠州灣海域樣本的宏條形碼分析以及利用高分辨率分子標記pgcp1(Songet al, 2020, 2022)和cox1(Songet al, 2021,2022)針對2019 年1 月膠州灣海域樣本的分子分析也鑒定到球形棕囊藻的存在, 與本研究結果相符, 表明青島海域不僅存在本底球形棕囊藻, 還具有一定的遺傳多樣性。

3.3 不同球形棕囊藻株系對青島海域突發性赤潮具有不同的貢獻

本研究基于18S rDNA V4 的宏條形碼分析發現,于2021 年冬季(12 月)在青島近海突然暴發的球形棕囊藻赤潮樣本中可以分辨出兩個主要 ASVs, 即ASV_2 和ASV_6。其中ASV_2 的相對豐度較高, 并隨赤潮的變化呈現顯著的動態變化, 隨著赤潮消退呈現下降趨勢(圖5)。說明造成此次赤潮的致災基因型是以ASV_2 所代表的這類球形棕囊藻株系。由此可以判斷, 不同株系對球形棕囊藻赤潮的形成具有不同的貢獻。從該赤潮暴發海域分離到的球形棕囊藻株系CNS01609 的18S rDNA V4 序列與ASV_2 序列在系統發育樹中聚在一起(圖6), 表明代表ASV_2 的球形棕囊藻株系在赤潮樣本中大量存在。

4 結論

18S rDNA V4 是迄今宏條形碼分析中最常用的分子標記(陳楠生, 2020)。本研究比較了兩對不同的18S rDNA V4 引物在擴增球形棕囊藻時的差別, 包括常用引物(即Stoeck 引物)和球形棕囊藻特異性引物(即Song 引物)。比較分析表明在展開宏條形碼分析時, 選擇合適的引物對于分析結果至關重要。宏條形碼分析結果表明, 青島近岸海域存在本底球形棕囊藻, 盡管相對豐度不高, 但是具有一定的遺傳多樣性,主要有兩種, 分別由ASV_2 和ASV_6 所代表。其中ASV_2 所代表的球形棕囊藻株系更可能是造成此次赤潮暴發的致災基因型, 表明不同球形棕囊藻株系在球形棕囊藻赤潮暴發過程中的貢獻不同。此外, 兩種代表ASVs 與環境因子的相關性分析表明, ASV_2所代表的球形棕囊藻株系與溫度呈顯著負相關。本研究表明利用Song 引物擴增分子標記18S rDNA V4 在鑒定其他大量浮游植物的同時, 不僅可以檢測到青島近岸海域存在本底球形棕囊藻, 還可以鑒定出2 種基因型的球形棕囊藻(ASV_2 和ASV_6)。因此, 在考慮選擇合適的引物開展針對球形棕囊藻以及其他定鞭藻的宏條形碼分析時, 建議選擇Song 引物(宋倫等,2016)開展基于18S rDNA V4 的宏條形碼研究。不過,如果研究目標只是球形棕囊藻的遺傳多樣性, 可以選擇利用高分辨率分子標記pgcp1(Songet al., 2020)或cox1(Songet al., 2021)。