不同基因型甘薯葉片酚類質量分數及PPO，POD活性的差異

冉海榕， 李佳欣， 傅玉凡， 陳培濤，王璐璐， 黃雨， 宗繼鍇， 羅青青

西南大學 生命科學學院/重慶市甘薯工程技術研究中心，重慶 400715

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是我國重要的糧食、 飼料和工業原料作物之一[1]． 隨著淀粉甘薯、 鮮食甘薯產業規模化和專業化的發展, 塊根成為主要的收獲對象, 而原先被作為飼料利用的藤蔓則被大量遺棄[2], 造成資源浪費、 病蟲害傳播． 甘薯藤蔓含有豐富的蛋白質、 維生素和礦物質以及多酚、 綠原酸等功能性物質[3-4], 不僅是營養豐富的飼料和葉類蔬菜來源, 還具有預防心血管等疾病、 提高人體免疫力等多種生理保健功能[5-6], 值得重視和開發利用, 如從甘薯品種渝紫薯7號、 西蒙1號中成功提取、 純化出多酚[7]和制作飲料沖劑等[8]． 酚類物質普遍存在于植物中, 在植物生長發育、 繁殖以及抗逆等過程中發揮著重要作用[9], 但容易被多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和過氧化物酶(peroxidase, POD)氧化成醌類物質從而降低果蔬等農產品的營養成分和商品品質, 造成經濟損失[10], 其合成與積累與PPO, POD的生理活性具有一定的相關性[11]． 除此之外, PPO, POD在乙醇生產、 啤酒風味陳化等食品加工、 污水處理等領域也具有重要的利用價值[12-13]．

就甘薯葉片中功能成分而言, 前人的研究多集中在酚類、 綠原酸、 黃酮等質量分數和組分的定性定量分析[14-15]、 抗氧化能力[16-17]等方面, 由于檢測方式、 實驗材料及其栽培因素的差異, 相關的研究結論具有一定的差異． 關于甘薯PPO, POD活性的研究也往往只針對于塊根, 如鮮切甘薯不同部位褐變機理差異[18-19]、 不同處理對酶活性的影響[20]等方面, 而甘薯葉片中關于這兩種酶的研究較少, 且只在少數品種中開展過兩種酶的分離純化與性質研究[[13, 21]． 由于葉片是藤蔓的主要部位, 其質量占比在50%以上[22], 有資料顯示多酚質量分數有器官依賴性[23], 且質量分數與綠原酸質量分數呈正相關[24], 因此, 本文對86個甘薯高級育種品系葉片中多酚、 綠原酸的質量分數、 抗氧化能力、 PPO和POD活性進行測定和分析, 以期為這些甘薯新品系的進一步鑒定、 藤蔓資源的利用提供一定的數據支撐, 也為PPO, POD的進一步研究奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的86個甘薯新品系或基因型, 均來自于重慶市甘薯工程技術研究中心合川農場基地2020年的品種比較試驗． 供試材料的編號、 名稱見表1．

表1 86個供試甘薯的編號、 名稱

1.2 田間試驗設計

采用隨機區組排列小區, 重復3次, 小區面積20 m2, 種植密度60 000株/hm2． 試驗于2019年5月17日至6月20日栽插, 常規性施肥、 中耕、 除草等田間管理．

1.3 取樣及其樣品制備

生長期110 d時在品種比較試驗的Ⅱ重復里取樣． 藤蔓自上往下第3～4節位采集新鮮無病斑、 無腐爛的葉片, 質量約100 g, 快速去除雜質、 切絲、 混勻后裝入紙袋, 置于電熱恒溫鼓風干燥箱于 40 ℃干燥至恒質量． 烘干的樣品用中草藥植物粉碎機粉碎, 過100目篩后、 密封低溫保存, 用于多酚、 綠原酸質量分數測定及ABTS自由基清除能力測定．

每個供試材料再隨機挑選3株藤蔓, 取其自上往下第3～4節位新鮮無病斑、 無腐爛的葉片, 快速去除雜質后稱質量, 錫箔紙包住液氮處理后-80 ℃保存, 用于PPO, POD活性測定．

取樣均重復3次．

1.4 總多酚提取與測定

標準曲線的制作: 參照張文婷等[14]的方法得到沒食子酸濃度(X)與吸光度(Y)的回歸方程:

Y=2.852 7X+ 0.054R2=0.999 0

樣液制備: 參照Sun等[5]的方法, 稍作修改． 準確稱取0.200 0 g粉末干樣, 加入70%乙醇8.0 mL, 浸泡提取16～18 h后, 超聲30 min, 5 000 r/min離心15 min, 吸上清液于50 mL離心管中, 向殘渣中加入70%乙醇8.0 mL 再次提取, 合并2次提取液, 于55 ℃條件下旋蒸, 用蒸餾水洗滌濃縮液, 定容, 得到總多酚提取待測液．

質量分數測定: 取0.20 mL待測液, 按照標準曲線的方法測定待測液吸光度． 總多酚質量分數表示為每克鮮質量的沒食子酸當量(gallic acid equivalent, GAE)毫克數, 計算公式為

C總多酚=(A×V1)/m×B

式中,C總多酚為總多酚的質量分數(mg/g);A為反應體系樣液濃度(mg/mL), 由標準曲線回歸方程計算可得;V1為定容體積50 mL;m為稱取的粉末干樣0.200 0 g;B為葉片干物質質量分數(%)．

1.5 綠原酸的提取與測定

標準曲線的制作: 參照傅玉凡等[17]的方法得到綠原酸濃度(X)與吸光度(Y)的回歸方程:

Y=0.028 7X-0.003 7R2=0.999 0

樣液制備: 參照傅玉凡等[17]的方法, 稍作修改． 準確稱取0.200 0 g粉末干樣, 加入50%乙醇20.0 mL, 浸泡提取20 h后, 超聲30 min, 5 000 r/min離心20 min, 吸上清液于50 mL離心管中, 向殘渣中加入 50%乙醇20.0 mL再次提取, 合并2次提取液, 定容得綠原酸待測液．

質量分數測定: 待測液稀釋20倍后, 在326 nm處測定待測液吸光度． 綠原酸質量分數表示為每克鮮質量的綠原酸當量(chlorogenic acid equivalent, CAE)毫克數, 計算公式為

C綠原酸=(A×n×V2)/(m×1 000)×B

式中,C綠原酸為綠原酸的質量分數(mg/g);n為稀釋倍數20;V2為定容體積50 mL．

1.6 ABTS自由基清除能力測定

樣品醇溶提取液的制備: 參照1.5方法制備4.0 mg/mL的醇溶提取樣液．

ABTS自由基儲備液的制備: 參照Re等[25]的方法． 計算使ABTS自由基活性降低50%的提取液濃度后, 換算成鮮基下的半數效應濃度(EC50), 分析EC50與鮮基下的總多酚和綠原酸質量分數以及PPO, POD活性的相關性．

S=[(A0-A1)/A0]×100

式中,S為ABTS自由基清除率(%),A0,A1為反應前后的吸光度．

1.7 PPO, POD活性測定

粗酶液提取: 參照李嬌洋[26]方法．

PPO活性的測定: 參照梁建榮[21]的方法并稍加修改． 反應體系為2.0 mL磷酸緩沖液, 加入1.6 mL鄰苯二酚, 再加入200 μL粗酶液, 于401 nm處比色測定, 用蒸餾水作為對照, 以每分鐘吸光度變化0.01為1個PPO活性單位(U/g·min)．

POD活性的測定: 參照付偉麗等[13]的方法并稍加修改． 反應體系為2.775 mL磷酸緩沖液, 加入0.1 mL愈創木酚, 0.1 mL H2O2, 再加入25 μL粗酶液, 于470 nm處比色測定, 用蒸餾水作為對照, 以每分鐘吸光度變化0.01為1個POD活性單位(U/g·min)．

1.8 數據處理

數據的整理、 計算用軟件 Excel 2019, 數據的相關性分析以及方差分析采用SPSS 26.0．

2 結果與分析

2.1 供試材料的分組

86個基因型有5組葉片色澤的品種群體(BC), 即BC1(紫綠), BC2(深綠), BC3(褐綠), BC4(綠), BC5(淺綠)． 根據葉片干物質質量分數測定得到的數據, 可將86個品種分為8組干物質質量分數基因型群體(DM)． 86個基因型在BC, DM中的分布見表2．

表2 86個甘薯基因型在葉片色澤和干物質質量分數群體上的分布

2.2 葉片干物質、 總多酚和綠原酸的質量分數、 EC50以及PPO, POD活性的多重比較

2.2.1 86個基因型間的比較

葉片干物質、 總多酚和綠原酸的質量分數等6項指標在86個基因型間的變幅、 平均值和變異系數如表3． 方差分析表明鮮基葉片的這6項指標在86個基因型間均有統計學意義．

表3 86個甘薯基因型6項指標的平均值、 變幅和變異系數

2.2.2 BC群體內不同基因型間和BC群體間的比較

葉片干物質、 總多酚與綠原酸的質量分數等6項指標在同一BC群體內部不同基因型之間的變幅、 平均值、 變異系數見表4．

干物質質量分數指標在群體內的變異系數相對較小, 而總多酚與綠原酸質量分數以及EC50指標變異系數居中, PPO, POD活性在BC群體內變異系數最大． 多重比較表明, 無論哪一個BC群體, 6項指標在群體內不同基因型間差異均有統計學意義(數據略)．

除POD活性外, 其余5項指標在BC群體間差異無統計學意義． BC1群體的POD活性顯著高于BC2群體和極顯著高于其余BC群體． POD活性在BC2-BC5群體間差異無統計學意義．

2.2.3 DM群體內不同基因型間和DM群體之間的比較

葉片干物質、 總多酚與綠原酸的質量分數等6項指標在同一DM群體內不同基因型之間的變幅、 平均值、 變異系數見表5．

DM群體內不同基因型間的葉片干物質、 總多酚與綠原酸的質量分數、EC50的變異系數普遍低于DM群體間的變異系數, 而PPO活性和POD活性的變異系數普遍高于DM群體間的變異系數． 葉片干物質、 總多酚與綠原酸的質量分數、EC50值以及PPO, POD活性6項指標在DM群體間的變異系數均高于BC群體間的變異系數． DM群體內不同基因型間比較表明, 葉片干物質、 總多酚和綠原酸的質量分數以及EC50差異無統計學意義, 而PPO, POD活性在群體內基因型間差異有統計學意義(數據略)．

葉片干物質質量分數在兩兩DM群體之間差異有統計學意義． DM8的總多酚與綠原酸質量分數均顯著高于其他群體, DM1與DM2之間的總多酚、 綠原酸質量分數差異無統計學意義, 但都顯著低于其他群體． DM1的EC50顯著高于其他群體, DM5至DM8群體之間的EC50差異無統計學意義, 但都顯著低于其他群體． DM1群體的PPO活性最大, 與DM5的PPO活性差異有統計學意義, 與其他DM群體之間差異無統計學意義． POD活性在8個DM群體之間差異無統計學意義．

2.3 相關性分析

2.3.1 總多酚質量分數與干物質和綠原酸質量分數、EC50的相關性

總多酚質量分數與干物質和綠原酸的質量分數、EC50的相關性如表6(群體內不同基因型之間相關性不明顯, 相關系數未列出)． 在86個基因型之間、 DM群體間的分析尺度上, 總多酚質量分數與干物質質量分數、 綠原酸質量分數均呈極顯著正相關, 與EC50呈極顯著負相關; BC群體之間, 總多酚質量分數與干物質質量分數呈極顯著正相關, 與綠原酸質量分數呈顯著正相關, 與EC50呈負相關． BC2, BC3, BC4, BC5群體內不同基因型之間的總多酚與干物質質量分數、 綠原酸質量分數呈顯著或極顯著正相關, 與EC50(除BC3外)呈極顯著負相關． DM群體內不同基因型之間, 總多酚質量分數與干物質質量分數相關性不明顯, 與綠原酸質量分數只在DM1和DM4群體內不同基因型之間呈顯著或極顯著相關性, 與EC50只在DM1和DM8群體內不同基因型之間呈顯著負相關, 而在DM6群體內不同基因型之間呈顯著正相關．

表6 總多酚質量分數與干物質和綠原酸質量分數、 EC50的相關性

2.3.2 綠原酸質量分數與干物質和總多酚質量分數、EC50的相關性

綠原酸質量分數與干物質和總多酚質量分數、EC50的相關性的趨勢類似表6(具體數據略)． 在86個基因型之間、 BC群體間、 DM群體間的分析尺度上, 綠原酸質量分數與干物質和總多酚的質量分數呈顯著或極顯著關系, 與EC50只在86個基因型之間和DM群體間呈顯著或極顯著負相關． BC群體內不同基因型之間, 除綠原酸質量分數與總多酚質量分數、EC50在BC1群體內相關性不明顯外, 其余情況下綠原酸質量分數與干物質和總多酚質量分數呈顯著或極顯著正相關, 與EC50呈顯著或極顯著負相關． 綠原酸質量分數與干物質質量分數只在DM1,DM2和DM5群體內不同基因型之間呈顯著或極顯著正相關, 與總多酚質量分數只在DM1和DM4群體內不同基因型之間呈顯著或極顯著正相關, 與EC50只在DM4群體內不同基因型之間呈顯著負相關．

2.3.3 PPO, POD活性之間及其與干物質、 總多酚與綠原酸質量分數、EC50的相關性

86個基因型之間、 BC4和DM1群體內不同基因型之間的分析尺度上, PPO活性與POD活性呈顯著負相關, 其余分析尺度下, PPO活性和POD活性之間沒有顯著的相關性． PPO活性與干物質質量分數只在DM1群體內不同基因型之間呈極顯著負相關, 與總多酚質量分數只在DM1和DM4群體內不同基因型之間呈顯著負相關, 與綠原酸質量分數只在DM1群體內不同基因型之間呈顯著負相關． POD活性與干物質質量分數只在DM3群體內不同基因型之間呈顯著正相關, 與綠原酸質量分數只在DM7群體內不同基因型之間呈極顯著負相關． PPO, POD活性與EC50在各種分析尺度下相關性均不明顯．

3 討論與結論

本文以甘薯藤蔓主要器官葉片為研究對象, 測定其干物質、 總多酚和綠原酸質量分數, 結果表明在86個基因型之間差異有統計學意義． 這與Sun等[5]、 王永徐[27]的研究結果相類似, 表明可以通過育種手段篩選出葉片總多酚、 綠原酸高質量分數的甘薯專用基因型; 也說明在多個淀粉基因型或多個鮮食甘薯基因型相當的情況下, 可以優先選用葉片總多酚、 綠原酸高的基因型, 便于綜合利用．

總多酚和綠原酸質量分數雖然在BC群體間差異無統計學意義, 但在深綠(BC2)或淺綠(BC5)群體葉片里變異系數較大, 且變幅的上限值相對較高． 總多酚和綠原酸質量分數在DM群體內不同基因型之間差異較小, 但在DM群體間差異有統計學意義, 且與杜曉華等[28]的研究結果相類似． 總多酚、 綠原酸質量分數在86個基因型之間、 BC群體間、 DM群體間以及BC群體內不同基因型之間多個分析尺度下均與相應的葉片干物質質量分數呈顯著或極顯著正相關性． 同時與梨果實[29]、 紅樹莓葉[30]、 黑核桃青皮[31]、 番石榴果實[32]等研究中的總多酚質量分數與抗氧化活性呈顯著的正相關相類似． 甘薯葉片醇溶提取液的ABTS自由基清除能力與其總多酚和綠原酸的質量分數呈顯著或極顯著正相關, 因此, 可以在深綠(BC2)或淺綠(BC5)群體里篩選葉片總多酚和綠原酸質量分數較高的功能性基因型, 并以葉片干物質質量分數為間接篩選指標． 就本文供試材料而言, 綜合考慮總多酚和綠原酸的質量分數以及ABTS自由基清除能力的EC50值, 編號50(BC5DM8群體里的15-10-2), 33(BC5DM7群體里的T85-5), 18(BC2DM8群體里的18-10-3)等可作為總多酚、 綠原酸功能成分育種資源或進一步鑒定篩選, 如15-10-2是一個薯塊食味好的品系, 而18-10-3是一個薯塊淀粉質量分數較高的品系． 值得注意的是83號18-6-24, 79號廣薯72葉片總多酚、 綠原酸質量分數相對不高, 但是其EC50值相對較低, 抗氧化活性較高, 可能與其總多酚、 綠原酸的組分種類有關系[33], 值得進一步研究．

本文86個基因型葉片之間的PPO, POD活性變幅較寬, 變異系數較大, 高低相差約35倍, PPO和POD活性與葉片色澤、 干物質質量分數以及總多酚和綠原酸質量分數僅在部分群體內有相關性, 且沒有明顯規律可循． 這可能與PPO, POD活性與遺傳、 植物代謝和環境等因素的關系較為復雜有關[34], 如植物酚類物質代謝途徑涉及到酶的種類繁多, 有時并不只與PPO, POD兩個酶[35]有關, 而且POD, PPO除了能夠將酚類物質氧化成醌類物質外, 還參與了木質素前體的聚合作用[36-37]． 本文中編號17(18-11-7), 43(18-1-1), 46(171404)的PPO活性相對較高, 編號5(161010), 10(161834), 84(18-6-1)的POD活性相對較高, 可進一步提取分離純化[13, 21]或作為種質資源在甘薯育種中加以利用．