血清脂肪酸結合蛋白4與3歲及以下兒童自閉癥譜系障礙診斷及神經發育的相關性

張靜靜,賈媛媛,胡苗苗,成勝權

自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是以早期社會溝通障礙、語言延遲和重復性感覺運動行為為特征的神經發育障礙[1,2],影響約1%的學齡前兒童[2,3]。盡管ASD被認為是由遺傳和環境因素之間的復雜相互作用引起的,但ASD發病機制仍不清楚[4,5]。ASD患兒與早期典型發育(typical developing,TD)兒童相比會表現出不同的發育差異[6]。大腦發育的關鍵時期是胚胎期至3歲[7],ASD兒童越早接受行為干預就越有可能緩解癥狀[8]。除了大腦發育差異,多數ASD患兒在早期發育階段還表現出與脂質代謝相關的特征,這是因為脂肪組織可分泌多種生物活性分子(脂肪因子),其中一些因子可調節大腦功能[9]。脂肪酸結合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)最近被鑒定為一種新型脂肪因子,被認為與脂肪酸(fatty acids,FAs)形成復合物,并作為細胞內FAs的伴侶因子在代謝綜合征的病理學中發揮重要作用,這已在精神分裂癥患者中得到證實[9,10]。然而,到目前為止,FABP4與ASD之間的關系尚未得到研究。因此,本研究檢查了≤3歲ASD兒童的血清樣本,以確定血清FABP4水平與神經發育特征之間的對應關系,以期為指導臨床預防和控制提供依據。

1 對象與方法

1.1 對象 2019-05至2022-04,從我院兒科和兒童心理科共招募60例ASD兒童(ASD組),男45例,女15例,平均(2.02±0.76)歲。納入標準:符合《精神障礙診斷和統計手冊》第5版(2013年)[11]中ASD診斷標準;兒童自閉癥評定量表(childhood autism rating scale,CARS)總分在30分以上;年齡≤3歲;首次確診。排除標準:診斷為其他精神疾病(如注意力缺陷多動障礙、強迫癥)、其他神經發育障礙、遺傳代謝疾病或嚴重神經疾病;腦損傷史;過去3個月內存在急性/慢性感染或使用任何FABP4補充劑;貧血、代謝紊亂、自身免疫性疾病。另外納入同時期正常發育兒童共68例作為對照組,納入標準:健康,已知無神經發育或神經系統疾病,無感染且未使用維生素補充劑,年齡(P=0.815)和性別(P=0.360)與ASD組相匹配,平均(1.99±0.69)歲,男46例,女22例,排除標準與ASD組相同。對于所有登記的兒童,均獲得了法定監護人的簽字知情同意書。這項研究獲得了我院倫理委員會的批準。

1.2 觀察指標 由ASD患兒和對照兒童的法定監護人完成了信息問卷,包括有關人口統計數據(例如,姓名、年齡和性別)、病史和食物偏好。ASD的癥狀用Kaufman兒童成套評價測驗(Kaufman assessment battery for children,K-ABC)、自閉癥診斷觀察量表第2版(autism diagnostic observation schedule second edition,ADOS-2)進行評估。K-ABC量表分為智力和成就兩個子量表[12]。ADOS-2(自閉癥診斷觀察量表第二版)是用于診斷和鑒別自閉癥的一種評估工具,包括重復刻板行為(restricted and repetitive behaviors,RRB)、社交影響(social affect,SA)兩個維度,2個維度得分相加即為總分,并根據模塊與年齡轉換為標準化的嚴重程度評分(calibrated severity score,CSS)[13]。分數越高,ASD嚴重程度越高。

1.3 神經發育評估 采用中國兒童神經心理行為檢查量表2016版(children neuropsychological and behavioral scale-revision 2016,CNBS-R2016)評估ASD患兒的神經發育水平,計算發育商(development quotient,DQ);DQ<70分定義為發育障礙(developmental disability,DD)[14]。根據DQ,我們將ASD患兒分為3個亞組:無DD,DQ≥70分;輕度DD,55分≤DQ<69分;中度及以下DD,DQ≤54分。對于交流警示行為能區,其得分<7分表示正常發育,7～<12分提示需要隨訪,12～30分表示有交流和互動障礙風險,>30分提示高度懷疑ASD[14]。

1.4 血清脂肪因子和代謝生物標志物的測定 采集研究對象3～5 ml全血樣本,血清分離,在室溫下凝固2 h或-4 ℃過夜,將血樣以1350 r/min離心20 min。采集血清并立即儲存在-80 ℃,直到分析。使用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(美國Cayman Chemical)測量血清FABP4濃度。此外使用夾心ELISA試劑盒(美國R&D Systems Inc.)測定脂聯素、瘦素水平。另外采用75 g葡萄糖耐量試驗檢測血清胰島素水平,葡萄糖氧化酶法檢測空腹葡萄糖水平。使用游離脂肪酸熒光測定試劑盒測量游離脂肪酸的水平。每個血清樣本分析兩次,取平均值進行分析。

1.5 統計學處理 使用SPSS26.0軟件處理數據,二分類變量以%(頻率)表示,進行χ2檢驗。偏態資料采用[M(Q1,Q3)]表示,進行Mann-Whitney U檢驗。相關性采用Spearman秩相關系數和多元線性回歸進行評估。采用logistic回歸模型分析ASD及神經發育障礙的影響因素。雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組兒童臨床特征資料比較 兩組兒童挑食、排斥蔬菜和肉類、血清瘦素、血清胰島素、血清葡萄糖水平差異無統計學意義,但ASD組血清FABP4、血清游離脂肪酸、血清脂聯素水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05,表1)。

2.2 血清FABP4水平與ASD的關系 將表1單因素分析中P<0.1的變量作為自變量,有無ASD作為因變量(無ASD賦值為0,有ASD賦值為1)納入多因素logistic回歸模型,結果顯示,血清FABP4是ASD的獨立影響因素(P<0.05,表2)。經ROC曲線分析,血清FABP4診斷ASD的曲線下面積為0.778(0.685～0.859),最佳截斷值為16.85 ng/ml,敏感度和特異度分別為86.8%和68.3%(圖1)。

表1 兩組兒童臨床特征資料比較 [M(Q1,Q3)]

表2 Logistic回歸分析血清自閉癥譜系障礙與脂肪酸結合蛋白4的關系

圖1 血清脂肪酸結合蛋白4水平與其他脂肪因子和代謝生物標志物的關系

2.3 ASD患兒血清FABP4水平與其他脂肪因子和代謝生物標志物的關系 經Spearman秩相關分析,血清FABP4與瘦素(r=0.352,P=0.006)、游離脂肪酸(r=0.789,P<0.001,圖2)呈正相關。進一步校正年齡和性別因素后,ASD患兒血清FABP4水平仍是血清瘦素(β=0.636,95%CI:0.293～0.979,P<0.001)和血清游離脂肪酸(β=19.038,95%CI:10.615～27.461,P<0.001)的獨立影響因子。

圖2 自閉癥譜系障礙患兒血清脂肪酸結合蛋白4水平與其他脂肪因子和代謝生物標志物的關系

2.4 ASD患兒血清FABP4水平與K-ABC、ADOS-2評分的相關性 經SPSS Spearman法分析,ASD患兒血清FABP4水平與K-ABC智力評分(r=-0.611,P<0.001)、成就評分(r=-0.557,P<0.001)、ADOS-2-SA(r=-0.421,P=0.001)、ADOS-2-RRB(r=-0.437,P<0.001)、總分(r=-0.422,P=0.001)、ADOS-2-CSS(r=-0.384,P=0.002)均呈負相關。

2.5 ASD患兒血清FABP4水平與神經發育水平的關系 DQ<70分亞組ASD患兒血清瘦素、血清游離脂肪酸、血清FABP4顯著低于DQ≥70分亞組(P<0.05,表3)。此外,進一步經Spearman相關性分析,3歲及以下ASD患兒血清FABP4水平與DQ(r=0.203,P=0.006),CNBS-R2016粗大運動(r=0.176,P=0.018)、精細運動(r=0.158,P=0.035)、語言(r=0.199,P=0.008)評分均呈正相關。此外,將單因素分析中有統計學意義(P<0.05)的變量進一步納入多因素分析,在校正年齡、性別等干擾因素后,血清FABP4水平是影響ASD患兒神經發育障礙的獨立保護因素(OR=0.677,95%CI:0.495～0.925,P=0.014)。

3 討 論

本研究分析了血清FABP4水平與≤3歲ASD患兒核心癥狀和神經運動發育水平之間的關系。結果發現ASD患兒血清FABP4水平普遍低于對照組兒童,且與3歲及以下ASD兒童DQ、CNBS-R2016粗大運動、精細運動、語言評分呈正相關,與K-ABC評分、ADOS-S評分呈負相關性,提示血清FABP4水平與≤3歲ASD患兒的神經運動發育水平密切相關。筆者不僅獲得了FABP4作為ASD發病基礎因子和早期診斷生物標志物的潛力數據,也可能為ASD“脂肪腦軸”假說提供了部分循證醫學支持。

全基因組關聯研究已經報道了ASD和肥胖的遺傳風險位點的重疊[15,16]。此外,低出生體重會增加患ASD的風險[17]。作為一種新型脂肪因子,FABP4則已被證明與脂質代謝紊亂、糖尿病和肥胖癥密切相關[18-20]。FABP4是脂肪酸結合蛋白質家族的一員,已被鑒定為與多種疏水化合物(如長鏈脂肪酸、各種環氧合酶和脂氧合酶代謝產物)相關的外周膜蛋白[21]。其他研究表明,脂肪細胞分化過程中FABP4表達增加,而長鏈脂肪酸(long-chain fatty acid,LCFA)、氧化低密度脂蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體γ和胰島素都可以改變FABP4活性[19]。FABP4被認為是一種脂質伴侶,因為它具有將LCFA與高親和力結合以提高其溶解度并在膜和細胞器之間穿梭的特性[9]。因此,FABP4可影響脂肪酸的攝取、運輸、酯化和β-氧化,并調節體內的能量平衡和脂質信號轉導。FABP4還將脂肪酸輸送到內質網和細胞核,以調節轉錄和脂質介導的信號傳遞,并調節酶的活性和生物膜的合成[10]。對于ASD兒童,除了社交能力和溝通能力持續不足,以及行為和興趣的受限和重復模式等核心特征外,也會逐漸影響胃腸、免疫、肝臟和內分泌系統。既往有研究發現3～12歲ASD兒童血液中的FABP4水平比其他兒童低得多[9]。這與本研究結果基本一致。本研究還發現,≤3歲的ASD兒童血清FABP4水平也明顯低于正常發育兒童,且與血清瘦素和血清游離脂肪酸呈正相關,這表明ASD兒童可能普遍具有低血清FABP4水平,并且在脂肪代謝紊亂中與瘦素、游離脂肪酸水平協同變化。此外,本研究結果還發現血清FABP4水平與K-ABC評分、ADOS-S評分呈負相關性,而且ROC曲線也支持了FABP4作為ASD早期診斷生物標志物的潛力。

表3 單因素logistic回歸分析血清脂肪酸結合蛋白4水平與自閉癥譜系障礙患兒神經發育障礙的關系

FAs從血液到大腦的運輸失調可能在ASD的病理生理中起著潛在的作用[9,22]。FABP超家族的另一成員FABP5在腦內皮細胞中表達,參與22碳六烯酸的攝取和隨后的血腦屏障運輸[22]。而FABP4在同一細胞群中表達[9]。因此,筆者推測FABP4可能也在ASD發病機制中發揮作用。它可能參與了FAs在血腦屏障中的轉運,并可能影響神經運動發育,這一點已在精神分裂癥患者中得到證實[23,24]。此外,既往報道顯示腦表達的FABP基因(FABP3、FABP5和FABP7)的遺傳變異參與了ASD和精神分裂癥的發病機制[9,25]。先前研究還發現,FABP4錯義突變會影響配體結合[9]。而且Maekawa等[9]也報道了與野生型小鼠相比,FABP4基因敲除小鼠對陌生小鼠的交流互動更少,且在空間學習和記憶方面有更多困難,證實了FABP4對ASD發病機制的遺傳貢獻。因此,我們推測外周FABP4可能通過改變腦內脂肪酸組成間接參與了ASD的發病機制。據報道,出生后的前3年是突觸形成的高峰期[26]。有證據證明,神經元增殖、髓鞘形成和突觸形成等生理過程對大腦的神經發育非常重要[27]。在之前的一項大規模外顯子組測序研究中,在ASD患者中發現了FABP4的從頭錯義變異[28]。他們通過外顯子組測序鑒定了102個ASD風險基因,其中大多數參與突觸功能和基因表達調控[13]。而FABP4與這102個候選物之間的蛋白質-蛋白質相互作用網絡顯示,FABP4與CREBBP、MED13L、PTEN和NCOA1相互作用[4,13]。這表明FABP4相關網絡在ASD神經發育機制中具有潛在作用。本研究也進一步探討了血清FABP4水平與ASD神經發育水平之間的關系。結果發現,血清FABP4水平≤3歲ASD患兒的DQ、粗大運動、精細運動、語言評分呈正相關,且血清FABP4水平是影響ASD患兒神經發育障礙的獨立保護因素。本研究結果表明,血清FABP4與ASD兒童的認知功能密切相關,而且相對較高的FABP4水平可能對ASD兒童的神經發育更有益。這些結果進一步支持了ASD“脂肪-腦軸”的假說。

綜上,本研究發現≤3歲ASD兒童血清FABP4水平低于正常發育兒童,且低血清FABP4水平與ASD兒童神經發育不良有關。對于≤3歲兒童,血清FABP4可能是用于ASD診斷和預測神經發育不良風險的候選生物標志物。本研究存在一些局限性,如樣本量較小,且FABP4在ASD中的具體作用機制仍未闡明,需要進行前瞻性和隨機對照試驗,以進一步觀察FABP4在ASD中的潛在作用。