銀杏葉和柿子葉黃酮類化合物提取條件優化研究

康林芝，侯嘉瑤，唐 輝

（韶關學院 食品學院，廣東 韶關 512005）

銀杏（Ginkgo bilobaL.）為銀杏科、銀杏屬落葉喬木，有“植物活化石”之稱［1］. 多年來，隨著人們對銀杏的深入了解，開始開發利用銀杏資源，其果實白果在藥用方面很有價值，也是銀杏利用率最高的部分，相比之下銀杏葉開發則缺乏力度. 銀杏葉是銀杏樹的干燥葉片，其中最主要的活性物質是黃酮類化合物和萜內酯類化合物［2-3］. 柿子（Diospyros kakiThunb.）在我國有著非常廣闊的種植范圍，人們都說柿子樹“全身都是寶”. 而柿子葉含有許多的黃酮類、鞣質類和酚類等物質［4-6］. 黃酮類化合物具有抗心血管疾病、抗腫瘤、抑菌及抗氧化等多種生理和藥理活性，可作為天然有效抑菌劑和抗氧化劑來源，黃酮類化合物的抑菌和抗氧化功效開發，可以為醫藥、食品和化妝品工業提供豐富的原料，因此應用前景十分廣闊［7-11］.

目前，黃酮類化合物提取的方法主要為溶劑提取和熱水提取，這兩種操作方法簡單易行，不需要昂貴設備，是國內外主要采用的方法，但是存在耗費時間長、提取率低的缺點［12］. 提取率低也是黃酮類化合物應用的一大阻礙，因此提高黃酮類化合物的提取率已成為進行黃酮產品開發需要解決的關鍵問題［13-15］. 超聲波法是目前新興的天然產物提取方法，此方法主要是通過超聲波輻射振動促使溶液中產生空化、機械及熱效應，從而起到加速溶質的溶解和擴散作用，大大地增大了提取效率［16-17］. 因此，筆者以銀杏葉和柿子葉為材料，以黃酮類化合物提取率為指標，利用超聲波輔助熱水提取黃酮類化合物，用正交試驗優化銀杏葉和柿子葉黃酮類化合物的提取工藝條件，以期為進一步開發利用銀杏葉和柿子葉資源提供參考.

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

銀杏葉、柿子葉，市售；蘆丁標準品（≥98% UV），西安天寶生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純，實驗用水為蒸餾水.

1.2 主要儀器與設備

酶標儀MultskanFC，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超聲波清洗機PS-40AL，深圳市華深科工設備有限公司；循環水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）ABS，上海凌科實業發展有限公司；恒溫水浴鍋HH-S28s，金壇市大地自動化儀器廠；旋轉蒸發儀RE-52B，上海雅榮生化儀器設備有限公司；電子分析天平FA2004，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；紫外超凈工作臺SW-CJ-1D，上海精密儀器儀表有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋BXM-30R，上海虔鈞科學儀器有限公司；恒溫培養箱，上海福瑪實驗設備有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 原材料預處理

把銀杏葉和柿子葉洗干凈，曬干表面水分后用真空烘箱中烘干，烘干的溫度設為50 ℃，烘干時長為5 h.待原料烘干后，用36 000 r·min-1的高速粉碎機將銀杏葉和柿子葉粉碎，過0.25 mm（60 目）分樣篩，處理好之后，用密封性良好的袋子裝好，置于陰涼干燥處，備用.

1.3.2 銀杏葉總黃酮提取條件優化單因素試驗

采用超聲波輔助水提取法對銀杏葉中黃酮類化合物進行粗提，將預處理好的銀杏葉粉和柿子葉粉分別稱取放于各個錐形瓶中，按一定料液比加入蒸餾水，加塞，在60 ℃恒溫水浴鍋中水浴相應時間，然后放入超聲波清洗機控制超聲功率超聲30 min，接著抽濾收集濾液，將濾液用蒸餾水定容. 以黃酮類化合物提取率為評價標準，選擇料液比、水浴時間和超聲波功率作為影響黃酮類化合物提取的因素，為正交試驗的設計提供依據［18-19］.

1.3.2.1 料液比對提取率的影響

按料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g·mL-1向裝有銀杏葉粉的錐形瓶加入蒸餾水，放在60 ℃的水浴鍋中水浴，控制水浴時間為1.5 h，超聲時間為30 min，超聲波功率為144 W. 超聲結束后抽濾，將濾液定容，在波長510 nm 處測定其吸光度. 結合蘆丁標準曲線計算黃酮類化合物的提取率.

按料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g·mL-1向裝有柿子葉粉的錐形瓶加入蒸餾水，60 ℃下恒溫水浴1.5 h，超聲30 min，超聲波功率為144 W. 抽濾，將濾液定容，測定其吸光度.

1.3.2.2 超聲波功率對提取率的影響

取5 個錐形瓶，每個錐形瓶加入銀杏葉粉，加入1∶30 g·mL-1的蒸餾水，60 ℃下水浴1.5 h. 分別控制超聲波功率為108、126、144、162、188 W. 抽濾后定容，測其吸光度，研究不同超聲波功率與銀杏葉黃酮類化合物提取率的關系.

稱柿子葉粉于5 個錐形瓶中，按料液比1∶30 g·mL-1加入蒸餾水，在60 ℃下恒溫水浴1.5 h，分別控制超聲波功率為108、126、144、162、188 W. 抽濾后將濾液定容，測定其吸光度，研究不同超聲波功率與柿子葉黃酮類化合物提取率的關系.

1.3.2.3 水浴時間對提取率的影響

取4 個錐形瓶，每個錐形瓶加入銀杏葉粉，加入料液比為1∶30 g·mL-1的蒸餾水，在60 ℃下恒溫水浴，水浴時間為0.5、1.0、1.5、2.0 h，超聲波功率為144 W. 超聲結束后過濾，將濾液定容，在510 nm 處測定其吸光度，研究水浴時間對銀杏葉黃酮類化合物提取率影響.

取4 個錐形瓶，加入柿子葉粉，加入料液比為1∶30 g·mL-1的蒸餾水，在60 ℃下恒溫水浴，分別控制水浴時間為1.0、1.5、2.0、2.5 h，超聲波功率為144 W. 超聲結束后過濾，將濾液定容，測定其吸光度，研究水浴時間對柿子葉黃酮類化合物提取率影響.

1.3.3 正交試驗

根據單因素試驗結果進行正交試驗，以黃酮類化合物提取率為指標，優選出銀杏葉和柿子葉中黃酮類化合物提取的最佳料液比、超聲功波率及水浴時間. 采用L9（34）正交表設計試驗，因素水平見表1 和表2.

表1 銀杏葉正交試驗因素水平

表2 柿子葉正交試驗因素水平

1.3.4 標準曲線的回歸方程

參照文獻［20-22］繪制蘆丁標準曲線，得到濃度c與吸光度Α的線性回歸方程為：Α=9.8214c+0.0404，相關系數R2=0.9994.

1.3.5 黃酮類化合物的測定及計算

移取銀杏葉及柿子葉的待測樣液各3 mL，放入10 mL 具塞比色管，按照標準曲線繪制的方法，先后加入5 mL 60%乙醇溶液、0.3 mL 5 %NaNO2溶液、0.3 mL 10 %Al（NO3）3溶液和4 mL 4 %NaOH 溶液，在波長510 nm 處測定吸光度，依照標準曲線的線性回歸方程計算出黃酮類化合物濃度，再根據以下公式計算出各待測樣液黃酮類化合物的提取率［16］：提取率（%）= （c×V1×V）/（V2×1 000×m）×100 %. 式中：c為待測樣液黃酮類化合物濃度，mg·mL-1；V為所得提取液的總體積，mL；V1為測試定容的體積，mL；V2為從提取液中量取進行測試定容的體積，mL；m為樣品粉末質量，g.

2 結果與分析

2.1 銀杏葉的單因素試驗

2.1.1 料液比對銀杏葉黃酮類化合物提取率的影響

如圖1 所示，隨著溶劑量的增加，提取率先上升后下降. 溶劑量較少時，樣液相對較稠，不利于超聲波的空化作用，導致超聲效果弱化，隨著溶劑量的增加，使黃酮類化合物分子傳質到溶液中的總量增多，也增強了超聲波的效果，所以，在料液比1∶20 到1∶30 之間，提取率上升并達到最大值. 料液比1∶30 后，黃酮類化合物浸出量反而有所下降，可能是由于繼續增加溶劑導致銀杏葉內雜質浸出，影響了黃酮類化合物的浸出，抑或是溶劑量過多影響了超聲波的機械學和熱力學作用［13，18］.

圖1 料液比對銀杏葉黃酮類化合物提取率的影響

2.1.2 超聲波功率對銀杏葉黃酮類化合物提取率的影響

超聲波功率過低，超聲波的空化作用和機械效應較弱，使黃酮類化合物提取不完全，當超聲波功率過高時，黃酮類化合物的滲出會受到阻礙，甚至會由于空化效應太過強烈而破壞黃酮類化合物的結構使得提取率下降［18］，因此選擇合適的超聲波功率對于物質的提取有著重要意義. 根據圖2 可知，提取率隨超聲波功率的上升先上升后下降，在108 W 到144 W 之間，提取率處于上升階段，在144 W 時，黃酮類化合物的提取率達到最大值，在此之后提取率則開始下降.

圖2 超聲波功率對銀杏葉黃酮類化合物提取率的影響

2.1.3 水浴時間對銀杏葉黃酮類化合物提取率的影響

如圖3 所示，銀杏葉的提取率在0.5~1.0 h 時先隨水浴時間的增加而上升，在1.0 h 時達到最大值. 在此階段，提取時間的增加使得銀杏葉粉內的物質向溶液中擴散的機率增大，因而提取率上升. 在此之后，則表現為隨著時間的上升提取率下降，原因是長時間的提取使得黃酮結構遭到破壞，或是銀杏葉內部的雜質溶出，與黃酮類化合物發生反應，破壞了其結構，導致吸光度降低，從而造成提取率降低［19］，由此可見，銀杏葉的最佳的水浴時間為1.0 h.

圖3 水浴時間對銀杏葉黃酮類化合物提取率的影響

研究在前期預試驗過程中發現，水浴時間達到一定值后，后續進行超聲提取時，超聲時間大于30 min則提取效率無明顯變化，因此，本試驗中銀杏葉和柿子葉總黃酮提取中未將超聲時間設置為單因素.

2.2 柿子葉的單因素試驗

2.2.1 料液比對柿子葉黃酮類化合物提取率的影響

料液比與柿子葉中黃酮類化合物提取率的變化關系如圖4 所示. 在1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 和1∶45 這5 個料液比之間，提取率呈先上升后下降的變化. 在1∶35 之前，溶劑量較低，黏度較大，阻礙了超聲波的空化作用，影響有效成分的浸出. 在料液比為1∶35 時，柿子葉中的黃酮類化合物提取率提取效果最好. 在此之后，可能是由于繼續增加溶劑導致柿子葉內雜質浸出，抑或是溶劑量過多影響了超聲波的機械學和熱力學作用，造成了提取率下降的現象.

圖4 料液比對柿子葉黃酮類化合物提取率的影響

2.2.2 超聲波功率對柿子葉黃酮類化合物提取率的影響

超聲波功率與柿子葉中黃酮類化合物提取率的變化關系如圖5 所示，在這5 個超聲波功率之間，提取率隨超聲波功率的上升先上升，到達126 W 之后，柿子葉的黃酮類化合物提取率有較明顯的下降，之后趨于穩定. 超聲波功率比較低時，超聲波的空化作用和機械效應較弱，使提取物浸出不完全，因此，隨著超聲波功率的升高提取率上升；當超聲波功率過高時，提取物的滲出會受到阻礙，甚至會由于空化效應太過強烈而破壞黃酮類化合物的結構使得提取率下降［21-22］；在超聲波功率達到一定值后，超聲介質內外滲透壓基本相等，對提取物的提取影響力變弱，此時提取率趨于穩定.

圖5 超聲波功率對柿子葉黃酮類化合物提取率的影響

2.2.3 水浴時間對柿子葉黃酮類化合物提取率的影響

水浴時間與柿子葉中黃酮類化合物提取率的變化關系如圖6 所示，隨著提取的水浴時間的增加，柿子葉的中的黃酮類化合物的提取率先上升后下降. 該變化的原因與銀杏葉提取效率隨時間上升而下降的原因相同，提取率上升是由于提取時間的增加使得提取物內的有效成分向溶液中擴散的機率增大，提取率下降則是由于長時間的提取使得黃酮結構遭到破壞，或是銀杏葉內部的雜質溶出. 結果顯示，在水浴時間為1.5 h 時柿子葉中的黃酮類化合物提取率最高.

圖6 水浴時間對柿子葉黃酮類化合物提取率的影響

2.3 正交試驗

2.3.1 銀杏葉的正交試驗

銀杏葉黃酮類化合物提取正交試驗結果見表3，通過各因素的k值和極差分析進行直觀分析，結果顯示各因素對銀杏葉黃酮類化合物提取效果的影響大小主次因素排序為：Α（料液比）＞B（超聲波功率）＞C（水浴時間），由此可得出，料液比是影響銀杏葉提取效果的重要因素. 由k值大小確定出銀杏葉提取最佳條件組合是Α1B1C1，為驗證正交試驗結果，按Α1B1C1重新設定試驗，試驗設置3 個重復，經過驗證試驗結果可知此條件提取率達到4.18%，與正交試驗結果較為一致. 因而銀杏葉中的黃酮類化合物提取的最優組合為料液比為1∶20，超聲波功率為144 W，水浴時間為1.0 h.

表3 銀杏葉的正交試驗結果

2.3.2 柿子葉的正交試驗

柿子葉黃酮類化合物提取正交實驗結果見表4，通過各因素的k值和極差分析進行直觀分析. 結果顯示對柿子葉黃酮類化合物提取效果的影響中主次因素排序為?。綜＞B，由此可得出，料液比是影響柿子葉黃酮類化合物提取效果的重要因素，其次是水浴時間、超聲波功率；由k值大小確定出柿子葉提取最佳條件組合是Α1B2C3，為驗證正交試驗結果，按Α1B2C3重新設定試驗，試驗設置3 個重復，經過驗證試驗結果可知此條件提取率達到2.54%（結果見表5），提取率高于正交試驗表中提取率最高組，結果較為準確. 因而柿子葉中的黃酮類化合物提取的最優組合為料液比為1∶35，超聲波功率為126 W，水浴時間為2.0 h.

表5 銀杏葉和柿子葉的驗證試驗

2.4 驗證試驗

對正交試驗的結果進行驗證，分別稱取銀杏葉和柿子葉各3 份，放于各自的錐形瓶中，銀杏葉按照優化方案Α1B1C1提取，柿子葉則按照優化方案Α1B2C3提取. 提取完成后進行黃酮類化合物的測定，計算黃酮類化合物的提取率. 結果如表5 所示，優化方案下的銀杏葉的黃酮類化合物提取率平均值為4.18%，柿子葉的黃酮類化合物提取率為2.54%. 該結果和正交試驗結果相符，說明此提取工藝重現性好且穩定.

3 結論

我國銀杏和柿子資源豐富，但是銀杏葉和柿子葉的利用率較低，為此本研究選用超聲波輔助提取法來提取銀杏葉和柿子葉的黃酮類化合物，以增加銀杏葉和柿子葉的利用率及附加值. 本研究以黃酮類化合物提取率為指標，通過單因素試驗和正交試驗，得出最優提取條件為：銀杏葉料液比1∶20，超聲波功率144 W，水浴時間1.0 h；柿子葉料液比為1∶35，超聲功率126 W，水浴時間2.0 h. 在最優組合條件下，銀杏葉的黃酮類化合物提取率為4.18%，柿子葉的黃酮類化合物提取率為2.54%. 本研究大大地提高了銀杏葉和柿子葉的黃酮類化合物的提取率，為銀杏葉和柿子葉的提取物應用于食品、化妝品行業提供參考.