獲能前后綿羊精子的差異蛋白質組學分析

毛飛，楊燕燕，蘇杰，，趙高平，李秀男，，王大清，巴音吉日嘎拉，曹貴方，*，王彩云*

(1. 內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2. 內蒙古農牧業科學院畜牧研究所，內蒙古 呼和浩特 010031；3. 內蒙古賽科星家畜種業與繁育生物技術研究院，內蒙古 呼和浩特 011517)

蛋白質組學是對組織或細胞中蛋白質的研究，精子蛋白質組學是鑒定精子中蛋白質的種類以及對其功能進行分析的研究。質譜技術的飛速發展為精子蛋白質組學奠定了基礎[8]。早期二維電泳(2-DE)可以分離蛋白質，分離出的蛋白質收集到數據庫中匹配；現在主要使用高效液相色譜使樣品預分集，與2-DE相比具有更好的覆蓋率與分辨率。精子的主要生成器官是睪丸，占所有已經鑒定組織特異性蛋白的1/3以上[9]。使用高效液相色譜與質譜聯用的蛋白質組學方法，鑒定出7 346種蛋白，其中有300個蛋白編碼基因主要在人類睪丸中表達[10]。有研究者使用串聯質譜標簽(TMT)技術結合液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術分析了杜泊羊精子體外獲能前后差異蛋白的表達，主要鑒定到的差異蛋白有熱應激蛋白質家族和前列腺特異性膜抗原(PMSA)家族等蛋白等[11]。本試驗利用生物信息學手段分析了綿羊精子獲能前后的差異表達蛋白，結合參考文獻篩選出乳鐵蛋白(LTF)進行驗證，為進一步研究杜泊羊體外受精技術奠定基礎，以便提高母羊受胎率，實現地區經濟效益的最大化。

1 材料與方法

1.1 綿羊精液

以手握法采集自內蒙古自治區呼和浩特市賽科星研究院2～4歲、體格健康的3只雄性杜泊羊精子。

1.2 主要試劑

全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、實時熒光PCR試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購自生工生物(上海)股份有限公司；LTF抗體、β-actin內參抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司；胰蛋白酶(Trypsin)、二硫蘇糖醇(DTT)、硫脲(Thiourea)、蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor)均購自Sigma公司。

1.3 精子獲能的處理

將綿羊新鮮精子4 ℃下111g離心10 min，用PBS重懸精子制成精子懸液，將精子濃度調整為1×108個/mL，均分為2份，即獲能前的對照組與獲能后的獲能組。獲能組置于獲能培養基(0.0194 g咖啡因，0.06 g BSA，140 IU肝素，pH=7.5～7.8)孵育1 h，將獲能組與對照組精子各取5 μL，考馬斯亮藍染色，封片觀察。

1.4 總蛋白的提取及濃度測定

將對照組與獲能組精子用等體積的PBS清洗，加入含有1 μL蛋白酶抑制劑、10 μL的磷酸酶抑制劑和PMSF的預冷裂解液。將精子用研磨法研磨，12 000g，4 ℃離心5 min，上清液即為精子蛋白，提取的精子蛋白在-80 ℃冰箱保存備用。采用BCA法測定蛋白質濃度，并繪制標準曲線。

1.5 SDS-PAGE

將精子細胞通過SDS-PAGE進行分離，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，厚度為1 mm，電壓為80 V，待蛋白條帶進入分離膠后將電壓調到120 V。電泳完成后，用考馬斯亮藍染色液對凝膠染色15 min，用脫色液脫色2 h。觀察蛋白條帶分布。

1.6 數據檢索與生物信息學分析

收集好各個樣本，采用FASP酶解法對蛋白質分解，取出部分酶解多肽，用反向高效液相色譜法(High PH RP)進行分級，將上述得到的各個組分使用數據依賴采集(DDA)與數據非依賴采集(DIA)進行數據采集與定量分析，每個樣本各采集1針。定量差異倍數閾值為≥1.5或≤0.6時選取為差異表達蛋白質，通過DAVID軟件進行GO分析，分別是生物進程、細胞組分和分子功能，通過KEGG在線數據庫對差異蛋白信號通路分析(北京奧維森基因科技有限公司協助完成)。

1.7 實時熒光定量驗證

將對照組與獲能組精子純化，用PBS洗3遍后向離心沉淀的精子團加入1 mL TRIzol 裂解液，室溫靜置 5 min后加入 0.2 mL 氯仿，室溫靜置5 min。4 ℃、12 000g離心，將上層水相小心移入新的 1.5 mL EP管，加入0.5 mL異丙醇，4 ℃、12 000g離心，棄上清液，加入1 mL經DEPC處理過的75%乙醇，4 ℃、7 500g離心。棄上清液，紫外分光光度計測量RNA的純度和濃度，參照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。所有操作均在冰上操作。

依據熒光定量說明書，將各個試劑置于冰上，按照2×ChamQ Μniversal SYBR qPCR Master Mix(10.0 μL)、上游引物(0.4 μL)、下游引物(0.4 μL)、 cDNA (1.0 μL)和ddH2O(8.2 μL)配置反應體系，總體積共20 μL。操作完成后，按照反應程序，每個樣品做3次重復。樣品基因為Lactoferrin，內參為Protamine，利用NCBI設計特異性引物，物種為綿羊，引物序列如表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot驗證

將篩選出的差異蛋白進行Western blot驗證。用SDS-PAGE分離獲能組與對照組的等量精子蛋白質，用轉膜儀將蛋白質轉移到PVDF膜上，轉膜后置于無蛋白快速封閉液中，于搖床上封閉15 min，分別加入LTF抗體(1∶1 000)、β-actin內參抗體(1∶9 000)，4 ℃孵育過夜。隨后用TBST清洗3次，孵育二抗(1∶2 000)2 h，清洗后顯色成像。

1.9 數據統計和分析

使用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行分析，使用t檢驗對數據進行顯著性分析，使用GraphPad Prism對數據分析并制圖。

2 結果與分析

2.1 綿羊精子獲能鑒定分析

通過咖啡因、肝素誘導的方法使獲能組精子發生頂體反應。如圖1所示，未獲能的精子頭部前段被考馬斯亮藍染成藍紫色(紅色箭頭)，獲能精子由于頂體破裂，精子頭部呈淺藍色(橙色箭頭)。表明精子體外獲能成功并發生頂體反應。

注：紅色箭頭代表未獲能，橙色箭頭代表獲能。

2.2 SDS-PAGE分析

精子細胞蛋白質樣品SDS-PAGE分析結果見圖2，對照組3個樣品與獲能組3個樣品的精子細胞蛋白質電泳條帶清晰。分離出的蛋白質質量大多在35～100 kDa。

M. Marker；1～3. 對照組3個樣品；4～6. 獲能組3個樣品。

2.3 獲能前后綿羊精子差異蛋白表達GO分析

鑒定到杜泊綿羊精子蛋白共2 118個，其中獲能前后差異表達蛋白203個，獲能后表達上調蛋白質27個，表達下調蛋白質176個。對203個差異表達蛋白進行GO分析，共有193個蛋白質存在注釋信息。從生物學進程(biological processes)上看，參與解剖結構發育(anato-mical structure development)的29個差異表達蛋白，上調3個，下調26個，參與生殖(reproduction)的25個差異表達蛋白，上調4個，下調21個(圖3A)。從細胞組分(cellular component)上看，定位在細胞溶質(cytosol)的差異蛋白有43個，36個下調，7個上調，定位在質膜(plasma membrane)的差異蛋白有33個，28個下調，5個上調(圖3B)。從分子功能(molecular functions)上看，參與氧化還原(oxidoreductase activity)的有2個上調蛋白，17個下調蛋白(圖3C)。

A. 生物進程分類；B. 細胞組分分類；C. 分子功能分類。

2.4 獲能前后綿羊精子差異表達蛋白質KEGG通路分析

為了獲得差異蛋白參與的信號通路，使用KEGG對差異蛋白進行通路分析。KEGG分析表明，差異蛋白參與到25個相關的信號轉導過程中，一些重要的信號通路如表2所示，其中，cAMP信號通路參與精子獲能、頂體反應和酪氨酸磷酸化等調節。蛋白酶體和精子移動有關，蛋白酶體與透明帶結合促進頂體胞吐，精子泛素化和蛋白水解酶抑制劑有助于阻礙精子多精入卵，蛋白酶水解被抑制改變精子獲能進程。Hedgehog信號通路與生物體組織器官的生長發育有關，在精子發生的早期過程中起到調控作用，除此之外，還可以促進卵巢中一些細胞的增殖、分化與修復。

表2 獲能前后綿羊精子表達差異蛋白質KEGG信號通路

2.5 獲能前后部分差異表達蛋白

由表3可見，在篩選出的差異蛋白中，3個精子蛋白在獲能過程中豐度增加，13個精子蛋白在獲能過程中豐度下降。上調蛋白包括精子發生與中心粒關聯1樣蛋白、ADAM金屬肽酶結構域2，下調蛋白包括乳鐵蛋白、β-防御素和精囊蛋白等，結合前人的研究，最終選取LTF做進一步驗證。

表3 獲能前后綿羊精子表達差異蛋白質列表

2.6 獲能對綿羊精子LTF表達量的影響

通過質譜分析篩選出LTF作為研究目標。通過實時熒光定量與免疫印跡對LTF表達分布進行分析。免疫印跡結果顯示(圖4)，LTF蛋白在對照組與獲能組均有表達，且獲能組的表達量低于對照組(P<0.000 1)。RT-qPCR結果顯示(圖5)，LTF基因mRNA在對照組與獲能組均表達，且獲能組表達量低于對照組(P<0.001)。

注：***表示P<0.001。

3 討論

蛋白質組學技術的發展對精子的功能提供了新的見解，鑒定到的蛋白質可以作為促進精子的生理功能的標志物。有研究者分析杜泊羊精子體外獲能前后差異蛋白的表達，鑒定到差異蛋白共有348種，其中上調蛋白280種，下調蛋白68種。鑒定的差異蛋白有VCP蛋白和PMSA家族蛋白，與本研究所鑒定出的差異蛋白一致。這些蛋白主要參與信號轉導、生殖等過程，也參與了蛋白酶體信號通路[11]。本研究鑒定到差異蛋白質數量與前人研究有所不相同，由于本研究設置的差異倍數閾值為≥1.5或≤0.6，而文獻中的差異倍數閾值是以1.5倍為變化；也可能是安徽與內蒙不同地域環境對杜泊羊個體差異的影響等因素導致。前人研究得出PMSA家族蛋白在蛋白質互作中作用明顯，而未具體研究信號通路分析。本研究得到的結果是在蛋白酶體信號通路中有PMSA家族蛋白參加。Hedgehog信號的調節表達是成人精子發生的一個特征，有研究表明Hedgehog信號通路參與小鼠精子的發生，通過SuFu蛋白可能會關閉單倍體生殖細胞中的Hedgehog信號傳導[15-16]。蛋白酶體是一種蛋白復合物，由催化蛋白和調節蛋白構成，可以降解結構發生錯誤的蛋白質。泛素與蛋白質連接后會產生泛素-蛋白酶系統(UPS)，UPS參與生殖過程中配子的發生、受精和獲能等過程[17]。蛋白質泛素化是一種穩定的共價修飾后翻譯，26S蛋白酶體和溶菌酶等可以降解底物蛋白。這種系統可以維持精子在受精時的正常功能，也是牛和其他哺乳動物卵母細胞和精子中存在的底物特異性蛋白質回收途徑[18]。有研究表明，精子攜帶的蛋白酶體參與精子獲能已在人和豬精子中發現[19]。 LTF對精子獲能可能也有重要作用，參與了cAMP途徑，對獲能的作用還需要進一步驗證。

LTF是一種分子量為80 kDa的鐵結合糖蛋白，屬于轉鐵家族，首次在牛奶中分離出來，并在人乳中證明是鐵結合糖蛋白[20]。LTF在黏膜分泌物廣泛存在，例如淚液、唾液、陰道黏液、精漿、鼻腔和支氣管分泌物、膽汁、胃腸道液體和尿液等，在血液中主要是由中性粒細胞產生[21]。LTF具有多種生物活性，參與多種生理和保護作用，主要有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗菌等活性[14]。LTF在綿羊精子冷凍前后有顯著變化，可能與綿羊精子冷凍后品質密切相關。LTF在先天免疫系統中起重要作用，存在于哺乳動物的精漿中，包括馬、牛、狗和人。LTF是種馬附睪分泌的最豐富的蛋白質之一，約占總蛋白質分泌量的 41% 。研究顯示精液中的LTF與精子濃度和總精子呈正相關。LTF在附睪體和尾部細胞中表達可與精子結合，可能在保護和調節精子活性方面發揮生物學作用。Zumoffen等[22]報道在人的輸卵管分泌物中檢測到LTF，研究顯示LTF可以促進生殖過程的調節，刺激精子獲能，調節精子亞群，使其與卵母細胞相互作用和受精。Kobayashi等[23]在牛的冷凍精液中添加了不同濃度的LTF，利用CASA分析了解凍后牛冷凍精液發現添加LTF有利于提高精子的活力和運動性能，人工授精率有所提高。Martins等[24]在冷凍馬精子中添加LTF有助于在冷凍期間保護馬精子。 Su等[25]研究發現10 μg/mL的LTF顯著改變了精子的活力。Estefanía等[26]研究發現LTF促進大鼠精子的體外獲能，誘導頂體反應的發生，影響胚胎移植的數量。在本研究中，LTF在獲能組中的表達量顯著降低，與前人研究結果一致。提示LTF對精子具有保護作用，且對獲能過程具有促進作用。

4 結論

本試驗鑒定出與綿羊精子獲能相關的差異表達蛋白共203個，其中27個上調蛋白，176個下調蛋白。蛋白參與解剖發育與生殖過程，也參加了cAMP和蛋白酶體等信號通路。并驗證發現LTF對精子獲能具有促進作用。