稻殼粉發酵飼料生產工藝參數優化及其營養成分變化

程彥茗，范陽，毛勝勇，丁立人

(南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095)

隨著我國反芻動物產業的快速發展，養殖業對粗飼料資源的需求量不斷增大[1]。當前，盡管我國一些現有的粗飼料資源如花生秸稈等已得到充分利用，但仍不能滿足產業需求，急需新開發有穩定來源的粗飼料資源[2]。稻殼粉是水稻加工的主要副產物(占水稻重量的20%以上)，是一類常見的非常規飼料資源。據報道，我國每年約產4 000多萬噸稻殼粉[3]，可利用資源十分豐富。但在實際生產中，稻殼粉中纖維素類物質約占63.67%，較高的木質纖維素影響了機體對其他營養物質的消化吸收。有研究報道，如果將稻殼粉作為飼料來源直接飼喂家畜，其消化率僅為5%～8%[4]。近年來一些研究發現，使用微生物發酵技術有助于提高稻殼粉的利用率[5]。Aderolu等[6]研究表明，使用綠色木霉菌(Trichodermaviride)處理稻殼粉40 d后，與發酵前相比，稻殼粉的代謝能和粗蛋白的含量顯著上升，而粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的含量顯著降低。Beg等[7]研究表明，使用糙皮側耳(Pleurotusostreatus)處理稻殼，與發酵原料相比，發酵稻殼粉的粗蛋白含量從2.15%增加到了9.3%，且消化率也上升了14.76%，而粗纖維、纖維素和木質素的含量分別減少了35.4%、19.7%和40.9%。然而，以前有關稻殼粉的研究多采用霉菌等真菌進行發酵，由于這些霉菌未列入飼料添加劑目錄，因而以這些微生物發酵生產稻殼粉存在潛在的飼料安全問題。乳酸菌、酵母菌、芽胞桿菌是飼料微生物目錄中的常見菌株，是否可以采用這些菌聯合發酵稻殼粉，并提高其飼料營養價值，目前并不清楚。

本試驗利用實驗室保存的3株菌，即植物乳桿菌L1(Lactobacillusplantarum)、枯草芽胞桿菌B6(Bacillussubtilis)和釀酒酵母菌S2(Saccharomycescerevisiae)混合發酵稻殼粉飼料，研究了稻殼粉發酵飼料在制作過程中的相關參數，最終篩選出發酵所需的最佳菌種比例和發酵條件，擬為發酵稻殼粉飼料的生產提供理論指導，為我國開發新型粗飼料資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

因稻殼粉營養成分含量較低，故添加玉米粉與豆粕粉作為發酵底物為菌種生長與動物飼喂提供營養，稻殼粉、玉米粉和豆粕粉三者重量比例為16∶3∶1，發酵底物由安徽大北農農牧科技有限公司提供。為促進微生物生長，將發酵底物的含水量調整至35%。發酵所用菌種為南京農業大學消化道微生物實驗室保存的植物乳桿菌L1、枯草芽胞桿菌B6和釀酒酵母菌S2。試驗所用的培養基購自南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 發酵菌液的制備

按0.1%(體積比)接種量將凍存的植物乳桿菌、枯草芽胞桿菌和釀酒酵母菌分別接種于對應的無菌液體培養基中，用MRS培養基活化植物乳桿菌，用LB培養基活化枯草芽胞桿菌，用YPD培養基活化釀酒酵母菌。將植物乳桿菌置于37 ℃恒溫箱靜置培養24 h，枯草芽胞桿菌置于37 ℃、140 r/min 搖床振蕩培養24 h，釀酒酵母菌置于30 ℃、140 r/min 搖床振蕩培養24 h。用接種環取少量菌液通過平板涂布法接種到無菌固體培養基中，培養24 h后挑取單菌落接種到滅菌后的液體培養基中，制成發酵菌液并測定各菌液的活菌數，活菌數>5lg CFU/g即可用于飼料發酵(植物乳桿菌活菌數>7lg CFU/g，枯草芽胞桿菌活菌數>6lg CFU/g，釀酒酵母菌活菌數>6lg CFU/g)。

1.3 固態發酵

取500 g固態發酵底物置于帶有單向透氣閥的聚乙烯袋中(規格為 300 mm×200 mm)，將發酵菌液按照不同的組合和接種量接種到固態發酵底物中，攪拌均勻并在發酵袋中留存部分空氣后封口，置于恒溫培養箱培養。

1.4 發酵稻殼粉菌種比例優化

采用L9(33)正交試驗設計，將各菌種按3個接種比例進行三因素三水平正交試驗，每個水平3個重復。按5%的接種量進行發酵底物的接種，接種后，于35 ℃固體發酵(自然pH值)5 d，測定發酵飼料pH值、乳酸菌活菌數、芽胞桿菌活菌數、酵母菌活菌數、乳酸濃度、揮發性脂肪酸濃度、纖維素、半纖維素和酸性洗滌木質素含量，上述指標經過Topsis(優劣解距離法)計算后，確定發酵稻殼粉飼料的最佳菌種組合。發酵稻殼粉飼料菌種組合的正交試驗設計見表1。

表1 發酵稻殼粉飼料菌種組合的正交試驗設計

1.5 發酵稻殼粉飼料的工藝優化

在確定3個菌種最佳接種配比之后，采用L9(33)正交試驗設計，將接種量(A)、發酵時間(B)、發酵溫度(C)3個因素進行優化，每個因素設3個水平，進行三因素三水平的正交試驗(表2)，每個水平3個重復，將上述發酵指標含量經過Topsis計算，確定發酵稻殼粉飼料的最佳條件。稻殼粉飼料的發酵條件優化的正交試驗設計見表2。

表2 稻殼粉飼料發酵條件優化的正交試驗設計

1.6 相關指標的測定

1.6.1 活菌數

在無菌條件下從各個處理組取1 g發酵產物置于滅菌后的離心管中，加入9 mL 0.9%無菌生理鹽水，混合均勻，置于4 ℃冰箱過夜，之后用稀釋涂布平板法測定3種菌株活菌數；用MRS 培養基測定乳酸菌數量、LB 培養基測定芽胞桿菌數量、YPD 培養基測定酵母菌數量。具體方法參照文獻[8]。

1.6.2 發酵指標

開袋后將發酵產物混勻，從各個處理組取2 g發酵產物置于離心管，加入2 mL超純水后靜置于4 ℃冰箱保存過夜，提取浸提液，用HI-9024C便攜式pH計(HANNA Instruments，美國)測定其pH值；取1 g飼料加入9 mL超純水混合均勻置于4 ℃冰箱過夜后，取上清液，采用氣相色譜法(GC-14B，島津，日本)測定其揮發性脂肪酸的含量[9]，并取上述上清液采用乳酸試劑盒(南京建成生物科技有限公司，南京)測定其乳酸的含量。

1.6.3 營養成分含量

從各個處理組取5 g發酵產物置于烘箱，105 ℃烘干至恒重后回潮，用于測定纖維素、半纖維素、酸性洗滌木質素等飼料常規養分，具體方法參照文獻[10]。纖維素含量的測定使用ANKOM-A200i自動纖維分析儀(美國)，粗灰分含量的測定使用一恒箱式電阻爐SX2-4-10N(中國)，粗蛋白含量的測定使用FOSS凱氏定氮儀2300(丹麥)，粗脂肪含量的測定使用索氏提取儀。

1.7 數據統計和分析

試驗數據采用Excel(2020)進行初步整理，使用SPSS 26.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用SNK(Student-Newman-Keuls)法進行多重比較檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。采用DPS數據處理系統中的Topsis法對發酵后的pH值、活菌數、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、纖維素、半纖維素、酸性洗滌木質素分別賦予-2、2、1、1、1、-1、-1、-1、-1的權重后計算評分。

2 結果與分析

2.1 發酵稻殼粉的菌種組合優化

2.1.1 不同菌種組合對發酵稻殼粉飼料中微生物數量的影響

由表3可知，試驗8、9組的乳酸菌數量極顯著高于其他組(P<0.01)，試驗5、7、8、9組的芽胞桿菌和酵母菌數量極顯著高于其他組(P<0.01)。

表3 不同菌種組合對發酵稻殼粉飼料中微生物數量的影響 lg CFU/g

2.1.2 不同菌種組合對發酵稻殼粉飼料的酸度、揮發性脂肪酸濃度和纖維素含量的影響

由表4可知，9個試驗組的pH值均小于4.5，其中第8組的pH值最低為4.39，但差異不顯著(P>0.05)；第3組的乳酸含量最高，為35.45 μmol/g，顯著高于第2、6、7、9組(P<0.05)；第1組的乙酸含量極顯著高于第5、8、9組(P<0.01)；第3組的丙酸含量極顯著高于第7、8、9組(P<0.01)；各組均檢測到少量的丁酸，其中第6組的丁酸含量最低，為0.18 μmol/g，極顯著低于第3、8、9組(P<0.01)；第1組的纖維素含量最低，為36.19%；第9組的半纖維素含量最低，為19.36%；第4組的酸性洗滌木質素最低，為6.76%，極顯著低于第1組(P<0.01)。

表4 不同菌種組合對發酵稻殼粉飼料的酸度、揮發性脂肪酸濃度和纖維素含量的影響

2.1.3 不同菌種比例的Topsis綜合評分

采用Topsis法對上述結果綜合多指標分析，表5結果顯示第2組得分最高，為0.611 8。因此，接種比例的最佳組合為第2組，即植物乳桿菌∶枯草芽胞桿菌∶釀酒酵母菌=1∶2∶2。

表5 不同菌種比例的Topsis綜合評分法結果

2.2 發酵稻殼粉發酵條件的優化

2.2.1 不同發酵條件對發酵稻殼粉飼料中微生物數量的影響

由表6可知，試驗1組(接種量為3%，發酵時間為48 h，發酵溫度為25 ℃)的乳酸菌、芽胞桿菌和酵母菌數量均顯著高于其他組(P<0.001)，其中乳酸菌數量比最低組高57.73%，芽胞桿菌菌數量比最低組高46.35%，酵母菌數量比最低組高50.00%。

表6 不同發酵工藝條件對發酵稻殼粉飼料中微生物數量的影響 lg CFU/g

2.2.2 不同發酵條件對發酵稻殼粉飼料酸度、揮發性脂肪酸濃度和纖維素含量的影響

由表7可知，第2組pH值最低，為3.81，極顯著低于第1、6、9組(P<0.01)；第7組乳酸最高，為40.51 μmol/g，極顯著高于第1、6、9組(P<0.01)；第9組的乙酸含量最高，為44.70 μmol/g，顯著高于第1、3、4、7組(P<0.05)；第6組的丙酸含量最高，為6.62 μmol/g；第7組的丁酸含量最低，為0.84 μmol/g；第3組的纖維素和半纖維素含量最低；第4組的酸性洗滌木質素含量最低，為15.43%。

表7 不同發酵工藝條件對發酵稻殼粉飼料酸度、揮發性脂肪酸濃度和纖維素的含量的影響

2.2.3 不同發酵條件的Topsis綜合評分

采用Topsis法對上述結果進行多指標綜合分析，表8結果顯示，第9組得分最高，為0.640 8。因此混合發酵稻殼粉工藝條件的最佳組合為第9組，即接種7%的菌液并在25 ℃的條件下發酵96 h。

表8 不同發酵工藝組合Topsis綜合評分法結果

2.3 發酵后稻殼粉飼料pH值及營養成分含量變化

按照篩選出的工藝參數發酵稻殼粉飼料，與發酵前稻殼粉進行pH值及營養水平變化比較，每組4個重復，結果如表9所示。發酵前后稻殼粉干物質含量、粗蛋白、粗灰分、粗纖維、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量沒有顯著差異(P>0.05)，pH值較發酵前極顯著下降(P<0.01)，酸溶蛋白和粗脂肪的含量均極顯著升高(P<0.01)。

表9 發酵后稻殼粉飼料pH值及營養成分含量變化(占干物質)

3 討論

我國稻殼粉產量豐富，但由于其纖維含量高且適口性差，較少在畜牧生產中使用。有研究表明，微生物發酵可以提高飼料的適口性并改善其營養成分。本試驗發現，稻殼粉發酵后，其發酵產物質地松散似砂礫，氣味酸香，結果表明，復合菌發酵可以改善稻殼粉飼料的感官品質。曲強[11]研究表明，發酵產生風味物質有助于改善菌糠飼料的適口性，增加動物食欲并提高采食量，顯著促進了育成羊的增重。因此，可推測發酵稻殼粉有利于提升動物的采食量。

單菌發酵和復合菌發酵是常見的2種生產發酵飼料模式。單菌種發酵是采用單一菌種進行發酵，大多使用乳酸菌，發酵條件與復合菌發酵相比，簡單可控，成本更低；而復合菌發酵是充分利用各菌種的協同發酵作用。有研究表明，復合菌發酵的交互作用使微生物代謝產物的營養成分要優于單菌發酵的結果[12]，在發酵飼料生產中使用枯草芽胞桿菌和釀酒酵母菌，不僅可將飼料中大分子物質轉化為小分子，還在發酵過程中消耗空氣，使飼料更快進入厭氧發酵階段，加快了植物乳桿菌生長代謝的速度，從而生成大量乳酸[13]。植物乳桿菌、枯草芽胞桿菌和釀酒酵母菌3株菌之間沒有拮抗作用，是用于共同發酵的常見菌株[14]，因此本試驗采用這3株菌對稻殼粉飼料進行發酵。本試驗發酵最佳組第9組的乳酸菌、芽胞桿菌和酵母菌活菌數均達到7.62 lg CFU/g 以上，說明3株菌在發酵底物上生長較好，而第2次發酵中的第2、3、6組活菌數含量較低，可能是飼料在發酵過程中產熱導致溫度超出環境溫度，達不到復合菌種生長的適宜溫度，且在較高溫度下，長時間發酵加速了菌種的衰亡。

研究表明，乳酸不僅可提高飼料適口性，還降低飼料pH值，進而抑制有害菌的生長，也提高飼料的有氧穩定性[15-16]。本試驗發酵最佳組第9組乳酸含量為29.23 μmol/g，說明飼料發酵較為充分。有研究表明，優質飼料的pH值一般為3.8～4.2[17]。本試驗發酵最佳組第9組pH值為3.93，達到了優質發酵飼料標準，且比第1次發酵pH值下降較多，說明合適的菌種配比可以有效降低飼料的pH值。乙酸是一種有效的抑菌劑，對條件致病菌(如腸桿菌、埃希氏菌等)有抑制作用，并能有效提高干物質的回收率和水溶性化合物的含量，有利于有機成分的保存并提高飼料的儲存性能[18-19]。本試驗發酵最佳組第9組的乙酸含量為44.70 μmol/g，發酵品質較好。張相倫等[20]研究提出布氏乳桿菌可將乳酸分解為乙酸，所以乙酸含量的提高可能也與乳酸的分解有關。丁酸是一種具有刺激性氣味的短鏈脂肪酸，有研究表明，丁酸的出現和梭菌代謝相關，梭菌可將糖類和乳酸等轉化為丁酸，不僅造成了干物質損失，而且生成的不適氣味會影響動物的采食[21]。本試驗第9組中的丁酸含量為1.11 μmol/g，說明發酵過程良好。

Topsis是一種常見的決策分析方法，通過對指標賦予權重，歸一后計算每個方案與理想方案幾何距離從而進行排序篩選出最佳方案[22]。該試驗選取發酵稻殼粉的pH值、活菌數、乳酸、揮發性脂肪酸、纖維素、半纖維素和酸性洗滌木質素的含量作為指標，分別根據其對飼喂動物的影響等賦予不同的權重，pH值在一定范圍內降低更有利于動物采食消化；活菌數代表接種菌種生長狀況；乳酸、乙酸和丙酸均為發酵優質產物；丁酸、纖維素、半纖維素和酸性洗滌木質素則對動物采食或消化飼料產生一定的負面影響，由此設置各個指標的權重，最終篩選出最佳的菌種配比和發酵條件。

發酵飼料營養成分的變化主要源于益生菌生長過程中對底物的降解和代謝產物的生成。朱曉峰等[23]研究表明乳酸桿菌固態發酵能降低菜籽粕硫代葡萄糖苷含量，改善其營養價值。本試驗結果表明，經過發酵后稻殼粉飼料的酸溶蛋白含量由7.74%上升到16.20%，提高了109.30%，可能是由于枯草芽胞桿菌將大分子蛋白質水解成少量氨基酸組成的小肽；粗脂肪的含量達到4.50%，提高了69.17%，粗蛋白的含量提高了0.94%，一部分是所加菌液中的培養基成分具有的營養物質導致的，發酵飼料干物質的損失造成的“濃縮效應”同樣會使其含量上升；發酵前后稻殼粉的纖維素含量均未顯著變化，可能是因為飼料有氧發酵時間較短，抑制了芽胞桿菌產生纖維酶的能力，或是枯草芽胞桿菌對不同種類的發酵底物作用有差異，而酸性洗滌纖維上升了2.67%，可能是由于益生菌生長消耗飼料中的有機物，造成一定的干物質損失導致的比例升高。

4 結論

本試驗通過正交試驗篩選了植物乳桿菌、枯草芽胞桿菌和釀酒酵母菌混合發酵稻殼粉飼料的最優工藝條件為：植物乳桿菌∶枯草芽胞桿菌∶釀酒酵母菌=1∶2∶2，接種量為7%，發酵溫度為25 ℃，發酵時間為96 h。經過發酵的稻殼粉飼料pH值顯著下降，酸溶蛋白和粗脂肪含量顯著上升，在一定程度上提高了其營養價值，但其在生產中的具體應用效果還需進一步試驗探究。