基于生物信息學分析miR-629-3p在頭頸部腫瘤發生中的作用

楊 軍 隋承光 李 妍 孟凡東

【提 要】 目的 探討微小RNA(miRNA-629-3p)在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達及其相關臨床意義。方法 通過TCGA數據庫數據進行生物信息學方法分析,獲得在頭頸部腫瘤中表達的微小RNA,選取高表達的miR-629-3p;K-M plot觀察miR-629-3p對患者生存的影響;TIMER2.0分析與免疫浸潤的相關性;Western blot法檢測相關蛋白的表達采用水平。結果 miRNA-629-3p在頭頸部腫瘤患者中高表達; miR-629-3p作為預測生存預后的一個指標具有較高的敏感度和特異度;免疫浸潤分析得出,T、B及NK細胞參與了頭頸部腫瘤的浸潤,且與miR-629-3p的表達具有明顯的相關性;沉默miRNA-629-3p后,Wnt、β-catenin和Survivin的表達水平明顯降低,而E-cadherin的表達水平明顯升高。結論 頭頸部腫瘤患者的miRNA-629-3p表達水平上調,可能在惡性轉化過程中起到重要作用,有望成為評估頭頸部腫瘤患者病情的有效指標。

頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous-cell carcinoma,HNSC)是目前最常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅人類的健康,主要累及頭頸部不同的組織和器官[1]。HNSC的臨床治療方案主要根據腫瘤的TNM分期制定。綜合治療以手術、放療、化療[2]及免疫治療為主[3]。HNSC的治療雖然取得了一定進展,但5年生存率并沒有顯著提高[4]。因此,早期診斷、準確的預后評估和進一步的有效治療是非常必要的。為改善疾病預后,全面了解腫瘤的發病機制,及時尋找可靠的腫瘤標志物提高HNSC患者的治療效果,制定有效的治療方案具有重要的臨床意義。

微小RNA(microRNA,miR)是一類由內源基因編碼的非編碼單鏈RNA,其數量僅占整個基因組的l%,主要在轉錄后水平調控基因的表達。miR-629-3p是一種促癌因子,已經被報道參與乳腺癌、肺腺癌和喉癌等惡性發展過程[5-6]。最新研究發現,miR-629-3p能夠被環狀DNAcircNRIP1海綿吸附,通過PTP4A1/ERK1/2信號通路影響宮頸癌細胞的侵襲[7]。Zhang等[8]發現miR-629-3p在膠質細胞源性神經營養因子處理的U251細胞中表達異常上調。

隨著對microRNA研究的不斷深入,實驗證據顯示其在細胞的發育、分化、遷移、凋亡等方面均發揮重要作用。目前尚無miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的相關研究,為此,本研究通過生信分析頭頸部腫瘤患者組織中miR-629-3p的表達情況及相關臨床意義,為進一步研發臨床治療方案提供一定的參考依據。

資料與方法

1.資料獲取

通過生物信息學網站The Cancer Genome Atlas(TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/)數據庫,篩選頭頸部腫瘤中高表達的microRNA,獲取患者的相關臨床資料,通過K-M plot對頭頸部腫瘤患者進行生存分析,GSEA(http://www.gsea-msigdb.org/)進行聚類分析,TIMER2.0數據庫獲得免疫浸潤的相關信息,Starbase數據庫預測與microRNA表達相關的信號通路。

2.材料

喉癌細胞株(TU212)購自上海細胞庫。所用試劑:DMEM培養基(Gibco),胎牛血清(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),PBS緩沖液(普諾賽)。Wnt抗體(abcam),Survivin抗體(abcam),E-cadherin抗體(abcam),β-catenin抗體(abcam),山羊抗兔二抗(abcam)等。

3.細胞培養

復蘇的TU212細胞加入含有10% FBS的DMEM培養液制備成細胞懸液,接種于培養瓶中,置于37℃,5%CO2培養箱中培養,每隔3天更換一次新鮮的培養液。

4.miR-629-3p瞬時轉染

取對數生長期的TU212細胞,PBS洗1次,胰酶消化,制成細胞懸液接種于6孔板中,當細胞長至60%時更換為無雙抗的培養基繼續培養,使用 miR-629-3p inhibitor干擾內源性miR-629-3p的表達,inhibitor NC作為陰性對照組,每孔的轉染量為50pmoi,48h后提取總蛋白,用于后續Western blot實驗。

5.Western blot法

為進一步驗證miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的作用,按照蛋白提取試劑盒說明書提取TU212細胞的總蛋白,電泳(上膠85v,下膠125v),轉膜(90mA,90min),洗膜,5% BSA封閉1h,一抗4℃過夜孵育,洗膜,二抗室溫搖床孵育1h,洗膜,發光。Image J軟件分析灰度值。

6.統計學分析

采用SPSS 22.0中的單因素方差分析,比較各組之間的差異。R包:主要采用ggplot2用于相關臨床數據分析,及可視化分析;survival包用于生存資料的統計分析;pROC包用于繪制ROC曲線。P<0.05視為差異有統計學差異。

結 果

1.microRNA的篩選

通過TCGA數據庫篩選頭頸部腫瘤中高表達的microRNA,設定條件:P<0.01,∣lgFC∣≥2,獲得結果為:miR-629-3p在頭頸部腫瘤中高表達(圖1)。

圖1 差異表達的火山圖

2.miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的表達

通過TCGA數據庫獲得miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的表達水平,結果顯示miR-629-3p在頭頸部腫瘤組織中高表達,與正常組織相比(P<0.01),差異具有統計學意義(圖2,A:配對樣本的差異分析;B:非配對樣本的差異分析)。

圖2 miR-629-3p的表達水平

3.miR-629-3p對頭頸部腫瘤的生存影響

miR-629-3p對頭頸部腫瘤患者生存的影響通過K-M plot數據庫得出,Nomogram列線圖顯示,5年的生存概率明顯低于1年和3年的生存概率;ROC曲線圖結果提示miR-629-3p對于生存率的預測具有一定的準確性(圖3,A:預后列線圖;B:ROC曲線)。

圖3 miR-629-3p對生存的影響

4.miR-629-3p的臨床意義及與免疫浸潤的相關性

從TCGA數據庫獲得頭頸部腫瘤患者的相關臨床資料,通過分析miR-629-3p與臨床患者TNM分期的相關性,得出miR-629-3p與頭頸部腫瘤患者的M期具有顯著的相關性(P=0.03),與N分期有一定的相關性(P=0.05),與T分期及年齡無明顯相關性(P>0.05)(圖4A)。

圖4 miR-629-3p的臨床意義

免疫細胞在很大程度上參與了腫瘤細胞的浸潤,TIMER2.0得出如圖4B所示結果,頭頸部腫瘤中miR-629-3p的表達與T細胞、B細胞呈明顯的正相關,與NK細胞呈負相關,得出T、B及NK細胞的表達會影響頭頸部腫瘤患者miR-629-3p的浸潤水平。

利用Starbase數據庫預測miR-629-3p可能參與的信號通路,分析預測結果并結合文獻,確定miR-629-3p參與Wnt信號通路的作用,進一步分析Wnt信號通路中相關蛋白的表達水平(圖4C)。

5. miR-629-3p參與信號通路中相關蛋白的表達

本實驗通過體外細胞實驗進一步驗證miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的作用,沉默TU212細胞中miR-629-3p的表達,觀察Wnt信號通路中相關蛋白的水平變化,結果顯示Wnt、β-cantenin和Survivin的表達水平明顯低于對照組的水平(NC組),差異具有統計學意義(P<0.05);而E-cadherin的表達水平與對照組相比,明顯升高(P<0.05)(圖5)。

圖5 蛋白表達水平

討 論

成熟的microRNA通過與多種蛋白質結合形成RNA誘導的沉默復合體,發揮其調控作用。某一種microRNA可以靶向調節多種基因的表達,某種基因的表達也可能受到多種microRNA的調控。研究發現,人類大約60%的基因都受到microRNA表達的調控。microRNA主要通過對靶基因的降解或抑制其翻譯來調控靶基因的表達。研究表明,microRNA在調節生物體生長發育、新陳代謝及凋亡等各個方面均發揮重要作用[9-10]。microRNAs通過堿基互補配對的原則,與特定mRNA的3′端非編碼區(3′UTR)的microRNA調控元件相結合,從而對靶基因進行識別。

miR-629定位于15q23,研究表明,miR-629可與相應靶基因mRNA的3′端非翻譯區互補結合,從而調控細胞的生長和分化過程,各類腫瘤的發生發展與它們的表達失調密切相關[11]。實驗研究發現,miR-629-3p可促進肺癌和乳腺癌的病程進展[12-13]。miR-629-3p可以通過調節PTP4A1和ERK1/2信號通路中相關因子的表達,抑制宮頸癌細胞的生物學功能[7]。miR-629-3p在人肺腺癌組織和細胞系中表達均上調,miR-629-3p通過下調SFTPC的表達可能會促進肺腺癌的疾病進展[12]。然而,關于miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的作用研究甚少。

本實驗通過生信TCGA數據庫,得出miR-629-3p在頭頸部腫瘤組織中高表達。Nomogram列線圖顯示,5年的生存概率明顯低于1年和3年的生存概率,ROC曲線圖顯示,miR-629-3p對于生存率的預測具有一定的準確性。推測miR-629-3p在頭頸部腫瘤有可能作為一種致癌因素起作用。通過分析miR-629-3p與臨床患者TNM分期的相關性,得出miR-629-3p與頭頸部腫瘤患者的N和M分期具有一定的相關性。

免疫細胞在很大程度上參與了腫瘤細胞的浸潤,本實驗頭頸部腫瘤中miR-629-3p的表達與T細胞、B細胞呈明顯正相關,與NK細胞呈負相關,得出T、B及NK細胞的表達會影響頭頸部腫瘤患者miR-629-3p的浸潤水平。利用生信Starbase數據庫預測結果并結合相關文獻分析,確定miR-629-3p參與Wnt信號通路作用,從而進一步檢測Wnt信號通路中相關蛋白的表達水平。Wnt信號通路可以調控胚胎干細胞、腫瘤干細胞、間充質干細胞等多種干細胞的不同生物學功能。Wnt是一類分泌型糖蛋白,Wnt信號途徑能引起胞內β-catenin積累,對腫瘤細胞的增殖、分化和遷移起到一定的調節作用。β-catenin作為一種黏附分子在喉癌細胞中呈高表達狀態,在基因的活化和轉錄過程中發揮重要作用,作為Wnt信號傳導途徑的核心元件,在胚胎發育階段通過介導Wnt信號,促進下游靶基因的轉錄,還可以作為細胞黏附蛋白細胞骨架網絡的結構組分,與腫瘤的發生、發展及轉移過程密切相關。E-cadherin蛋白主要介導細胞與細胞間的黏附,其表達水平與腫瘤細胞的侵襲和轉移能力呈負向相關。它的異常表達與腫瘤的形成、復發和轉移有關。Survivin在細胞中呈周期依賴性表達,具有抑制腫瘤細胞凋亡、參與細胞周期調控的雙重功能,可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性。

本實驗為進一步驗證miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的作用,通過Western blot法檢測沉默miR-629-3p后,Wnt信號通路相關蛋白的表達,結果顯示Wnt、β-catenin和Survivin的表達水平明顯降低,而E-cadherin的表達水平明顯升高,進一步驗證了miR-629-3p在喉癌細胞中作為一種致癌因子存在。miR-629-3p有可能作為評估頭頸部腫瘤患者病情及預后的指標,也為其靶向治療提供相關的數據基礎。