胃癌組織和遠癌組織β-catenin 的表達及臨床意義

陳海軍 孫梓程 劉 巖 由光玉 洪東寧

（南通市第六人民醫院普外科，江蘇 南通 226000；2.牡丹江市第一人民醫院，黑龍江 牡丹江 157001）

本研究以臨床腫瘤標本為研究對象，通過實時熒光定量PCR 及West-bloting 的方法對胃癌組織中Wnt 信號通路中β-catenin 蛋白的表達狀況與臨床病理因素之間的關系進行分析，探討其在胃癌發生發展中的作用機制，為臨床治療提供可能的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取我院手術切除的胃癌標本32 例為研究對象，其中男19 例，女13 例，中位年齡56 歲（39～79 歲），所有患者術前均未進行新輔助化療。胃底賁門部腫瘤4 例，胃體部腫瘤8 例，胃竇部腫瘤20 例；pTNM 分期Ⅰ期，Ⅱ期共24 例，Ⅲ期，Ⅳ期共8 例；無淋巴結轉移12 例，伴有胃周淋巴結轉移20 例；低度分化8 例、中等分化16 例、高分化腺癌8例。取胃癌組織和距癌腫邊緣5 cm 的遠癌組織后迅速-80 ℃凍存并盡早檢測。

1.2 實驗儀器和試劑 ECL 發光試劑盒；KAPA SYBR FAST qPCR Kit；抗人β-catenin 單克隆抗體、內參GADPH 抗體、二抗SP 免疫組化試劑盒；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒；BIO-RAD CFX96 實時定量PCR 儀；垂直電泳和水平電泳。操作步驟按說明進行。

1.3 方法 （1）RNA 提取及純度測定：將得到胃癌組織及遠癌組織分別稱重，切碎，在液氮中研磨，并加以TRIzol 試劑進行裂解處理。加入氯仿200 μL，劇烈振蕩，放置室溫下。4 ℃條件下，以12000 rpm 轉速離心15 min，收集上清（約500 uL），加入異丙醇混勻。冰上孵育。再次離心后棄去上清液。加入預冷的75 乙醇1 mL。4 ℃8000 rpm 離心10 min，棄上清。重復上述步驟，RNA 沉淀在室溫下干燥，提取出總RNA。DEPC 處理的水溶液將RNA 溶解，核酸定量分析儀測RNA 純度，OD260/280 比值在2.0 左右，-80 ℃冰箱凍存備用。根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，所得的cDNA 置于-20 ℃保存備用。（2）實時熒光定量PCR 檢測β-catenin 基因表達：設計目的基因β-catenin 和內參基因GAPDH 引物序列并委托上海生物工程有限公司合成，采用非特異性SYBR Green 熒光染料法檢測。先驗證引物退火溫度及特異性，選取特異性高的引物作為后續研究。反應體系配制：2×SYBR Green mix10μL，上游/下游引物（10 μmoL）各0.4μL，cDNA 1μL，補雙蒸水至終體積為20 μL，加蓋混勻，按照預變性：95 ℃，30 s；變性：95 ℃，5 s；退火延伸：60 ℃，30 s 反應條件進行擴增并構建溶解曲線。β-catenin：上游引物：5- GGACAAACCACAGGATTACA -3，下游引物：5-TCCACCACAGTGAAAAGAAC-3，長度180bp；GAPDH：上游引物：5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3，下游引物：5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3，長度258bp。（3）West-blot 法檢測β-catenin 蛋白的表達：分別取0.1 g 胃癌組織和遠癌組織，經蛋白提取、定量后稀釋成5 ug/uL 濃度，加入上樣緩沖液Loading-Buffer 混勻煮沸5 min，上樣，SDS-PDGE 膠電泳，轉膜，將轉膜后的PVDF 膜在5%脫脂奶粉封閉，分別加目的蛋白一抗及內參一抗（1：400）4 ℃冰箱過夜孵育，次日PBST洗膜3 次，5 min/次，用5%脫脂奶粉稀釋的二抗（濃度1：2000）室溫孵育1 h，PBST 洗膜3 次，5 min/次，ECL 發光，暗室膠片曝光。以GAPDH 為內參，采用儀器自帶軟件進行定量分析并記錄其相對光密度值。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 軟件處理，計量數據以（±s）表示，用t 檢驗；計數資料用[n（%）]表示，用χ2檢驗或Fisher 確切概率法，組間比較用Kruskal-Wallis H 檢驗，其表達相關性用Spearman 秩相關性分析。

2 結果

2.1 RT-PCR 擴增產物的特異性 RT-PCR 采用兩步法擴增，適宜退火延伸溫度為60 ℃，熔解曲線示集中單峰，表明特異性較好；β-catenin 與GADPH 標準曲線斜率一致性較高，表示二者擴增效率基本一致。采用ΔΔC（t）法，以人GADPH 基因為內參，遠癌組織β-catenin mRNA 相對表達量為1.000，胃癌組織中β-catenin mRNA 表達明顯高于遠癌組織，差異顯著（P＜0.05），β-catenin 基因PCR 擴增產物電泳結果：A.胃癌組織B.遠癌組織，見圖1。

圖1

2.2 β-catenin 蛋白的表達 West-bloting 結果顯示：胃癌組織中β-catenin 蛋白表達量高于遠癌組織表達量，差異顯著（P＜0.05）。West-bloting 法檢測胃癌組織及遠癌組織β-catenin 蛋白的表達情況，見圖2。

圖2

2.3 遠癌組織與胃癌組織β-catenin 基因與蛋白相對表達量統計 胃癌組織的β-catenin mRNA 和蛋白的表達量顯著高于遠癌組織表達量，差異顯著（P＜0.05），見表1。

表1 遠癌組織與胃癌組織β-catenin 基因

2.4 胃癌組織β-catenin 的表達與臨床病理特征之間的關系 β-catenin 蛋白的陽性表達在低分化、晚期腫瘤及有淋巴結轉移的胃癌組織中表達相對較高，但與年齡、性別、部位、分化程度、TNM 分期、淋巴結有無轉移等臨床病理特征之間無明顯相關性（P＞0.05），見表2。

表2 胃癌組織β-catenin 的表達與臨床病理

3 討論

Wnt 信號通路是一條進化比較保守的信號傳導途徑，存在于各種動物體內，參與細胞增殖、分化和凋亡的調控，在胚胎發育和細胞命運的決定中發揮重要作用，它包括Wnt/β-catenin 信號通路、Wnt/Ca2+信號通路及由c-Jun N 端激酶（JNK）介導的細胞極性信號通路等細胞內信號通路[1]。Wnt/β-catenin 信號通路是Wnt 信號通路的經典通路，由Wnt 蛋白、跨膜受體、胞質蛋白、核內轉錄因子等，位于胞質內的散亂蛋白（Dsh）、結腸腺瘤樣息肉病蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、軸蛋白（Axin）及β-連接蛋白（βcatenin），核內轉錄因子如轉錄活化因子CBP 及T 細胞轉錄因子/淋巴樣增強因子（TCF/LEF）等[2]。盡管Wnt 信號通路由多種蛋白構成，但β-catenin 在細胞內濃度可改變各種調節因子，使腫瘤細胞的遷移及侵襲能力加強。研究表明[3]細胞中β-catenin 的表達與腫瘤的轉化和浸潤密切相關。Ishigaki K[4]通過研究胃癌細胞和原發性胃癌β-catenin 基因突變和表達情況，發現基因的突變與β-catenin 蛋白在核內堆積有相關性，推測β-catenin 異常的細胞內分布與細胞惡性轉化、增殖密切相關[5]。

多研究表明Wnt 信號通路激活與腫瘤轉移存在一定關系[6]。β-catenin 是Wnt/β-catenin 信號通路關鍵信號分子，我們采用實時熒光定量PCR、West-bloting 的方法，比較胃癌組織和遠癌組織標本β-catenin表達的水平，觀察到遠癌組織內β-catenin mRNA 及蛋白都呈低表達，而胃癌組織內的β-catenin mRNA及蛋白表達較遠癌組織升高（P＜0.05），提示β-catenin參與胃癌的發生與發展過程。Wnt/β-catenin 信號通路下游靶基因如原癌基因c-myc、細胞周期蛋白D1和金屬蛋白酶等在腫瘤的發生和轉移中扮演重要作用，而β-catenin 與下游靶基因之間構成了一個錯綜復雜的網絡[7]。本研究中β-catenin 蛋白的陽性表達與腫瘤發生部位、分化程度、分期及有無淋巴結轉移及患者性別、年齡因素無明顯相關性（P＞0.05），與上述結果不一致，提示我們β-catenin 在胃癌轉移過程中的作用機制目前仍不清楚，隨著分子生物學技術的不斷發展，相信轉錄因子β-catenin 的功能將不斷被發現，其作用機制及信號通路將會進一步被闡明，也為胃癌的臨床診療提供一個新的靶點。