蒙藥赤瓟子的提取及其鎮痛抗炎作用的實驗研究

唐曉光 劉倩 陳曉北 張聰穎

摘 要：目的：采用響應面法優化赤瓟子的提取工藝，評價蒙藥赤瓟子乙醇提取物的鎮痛抗炎活性。方法：采用單因素試驗考察提取時間、提取溫度、液料比、乙醇濃度對赤瓟子提取率的影響，依據Box-Behnken組合設計，確定其最佳提取工藝。采用熱板法和扭體法考察赤瓟子乙醇提取物的鎮痛活性，采用二甲苯致小鼠耳腫脹法和雞蛋清致大鼠足腫脹法考察赤瓟子乙醇提取物的抗炎活性。結果：赤瓟子最佳提取工藝，液料比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度分別為15：1ml/g、68%、1h和80℃。蒙藥赤瓟子乙醇提取物能顯著延長小鼠的痛閾值和扭體的潛伏期，顯著降低冰乙酸誘發的小鼠扭體次數，顯著抑制雞蛋清所致的大鼠足腫脹和二甲苯所致的小鼠耳腫脹。結論：蒙藥赤瓟子乙醇提取物具有顯著的鎮痛抗炎活性。

關鍵詞：蒙藥，赤瓟子；鎮痛；抗炎

中圖分類號：R285.5；R289.5? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2023）09-0063-05

赤爮子蒙藥名為敖樂木色，為葫蘆科植物赤瓟Thladiantha dubia Bunge的干燥成熟果實，又名赤雹、氣包、山屎瓜等，廣泛分布于內蒙古、東北三省、華北、陜西等地，性甘、酸、平，具有活血、化瘀、調經之功效，常用于陰道疾病、血瘀宮中、血痞、經閉、皮膚病等的治療[1]。赤瓟子作為民族藥，不僅作為蒙藥使用，還在滿族民間應用，常用來治療多種疼痛，如腰腿痛、痛經、風濕痛、乳房脹痛等[2]。研究發現，赤瓟子具有顯著的抗炎活性[3]。目前關于赤瓟子的報道主要集中于赤瓟子水提物或其中某類成分的單一藥理作用，而其乙醇提取物的鎮痛抗炎活性報道較少。本研究通過熱板法、扭體法評價赤瓟子乙醇提取物（CPZE）的鎮痛活性，采用二甲苯和雞蛋清致炎法評價CPZE的抗炎活性，為蒙藥赤瓟子的臨床合理應用和藥物的研發提供參考依據。

1 實驗材料和動物

1.1 實驗動物

昆明種小鼠，雌雄各半，SPF級，體質量范圍20±2g；SD大鼠，雌雄各半，體質量范圍200～220g，大鼠和小鼠均由北京科宇動物養殖中心提供，動物合格證號為SCXK（京）2018-0010。采購實驗動物后，先進行適應性喂養7天，飼養環境：飼養溫度20～24℃，相對濕度（55±5）%，通風良好，明暗適宜。

1.2 實驗儀器

數顯水浴鍋（HH-2，江蘇恒隆）；旋轉蒸發儀（RE-2000E，上海尚儀）；循環水真空泵（SHZD-III，河南予華）；超聲波清洗機（KQ-250E，昆山舒美）；電子天平（美國，梅特勒AE240）；智能熱板儀（成都泰盟科技，ＲB-200）；6mm打孔器；數顯游標卡尺；灌胃針，注射器等。

1.3 藥品與試劑

赤瓟子（本品為自采藥用植物，經赤峰學院王洪俠副教授鑒定為赤瓟子的成熟果實），阿司匹林泡騰片（產品批號：1911168，阿斯利康），冰乙酸（產品批號：20120808，國藥集團，分析純），二甲苯（產品批號：20180203，天津天力，分析純），95%乙醇（盤錦天源，分析純），10%雞蛋清溶液（現用現配，溶劑為生理鹽水），無菌蒸餾水（實驗室自制），生理鹽水等。

1.4 實驗分組及給藥劑量

熱板法、扭體法、二甲苯致耳腫脹實驗分組：取小鼠80只，雌雄各半（熱板法全部用雌性小鼠），隨機分成陽性對照組（陽性藥為阿司匹林）、CPZE高劑量組、中劑量組、低劑量組和空白對照組，以上5組給藥劑量分別為0.03g·kg-1、6g·kg-1、3g·kg-1、1.5g·kg-1和對應濃度等體積的生理鹽水。雞蛋清致大鼠足腫脹實驗分組：取SD大鼠72只，雌雄各半，隨機分6組，在上述分組基礎上增設模型組，空白對照組和模型組給予對應濃度同等體積的生理鹽水，CPZE高劑量組、中劑量組和低劑量組給藥劑量應根據小鼠給藥劑量、大鼠體質量換算成大鼠的給藥劑量，陽性對照組阿司匹林給藥劑量為人臨床極量根據大鼠體質量換算成大鼠的給藥劑量。

2 赤瓟子提取工藝實驗方法

2.1 赤瓟子提取工藝的優化

2.1.1 藥材預處理

赤瓟子打碎過60目篩，在烘箱內恒溫干燥24h，直至重量不再變化。

2.1.2 赤瓟子的提取

稱量赤瓟子20g，加適量乙醇浸泡24h，回流提取2次，提取液減壓蒸餾至恒重，按下列公式計算浸膏質量和提取率（%）。

浸膏質量（g）=蒸餾后圓底燒瓶（含浸膏）的質量（g）-蒸餾前圓底燒瓶的質量（g）

提取率（%）=（浸膏質量÷20g）×100%

2.1.3 單因素試驗

取赤瓟子粗粉80g，平均分成4份，通過單因素試驗評價提取溫度、提取時間、料液比和乙醇濃度對赤瓟子提取率的影響。提取溫度對赤瓟子提取率的影響：按照液料比15：1mL/g加一定濃度的乙醇，設定5個提取溫度（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃），每個溫度下提取2次，每次提取1h，每個溫度下實驗重復2次，計算平均提取率。提取時間對赤瓟子提取率的影響：按照液料比15：1mL/g加一定濃度的乙醇，選擇7個不同的提取時間（30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min），在80℃下回流提取，提取次數、實驗重復次數和提取率計算同上。液料比對赤瓟子提取率的影響：選擇6個不同的液料比，加70%的乙醇，在80℃下回流提取1h，提取次數、實驗重復次數和提取率計算同上。乙醇濃度對赤瓟子提取率的影響：按液料比為15：1mL/g，選擇5個不同濃度的乙醇為提取溶劑，即50%、60%、70%、80%、90%，在80℃下回流提取1h，提取次數、實驗重復次數和提取率計算同上。

2.2 赤瓟子乙醇提取物的制備

稱量干燥赤瓟子粗粉500g，加2倍量68%乙醇浸泡24h，用15倍量的68%乙醇在80℃下回流提取2次，每次提取1h，趁熱過濾，合并提取液，置旋轉蒸發儀中減壓蒸餾，回收乙醇，蒸至浸膏恒重，稱量適量的CPZE，將其稀釋成6g·kg-1、3g·kg-1、1.5g·kg-1的溶液，即為CPZE的高劑量組、中劑量組和低劑量組。

2.3 熱板法

根據《藥理實驗方法學》中記錄的方法[4]，取智能熱板儀，設置溫度為（55±0.5）℃，待溫度恒定后，將小鼠置于熱板儀中，觀察并記錄小鼠第一次添后足的時間，該時間即為小鼠的痛閾值。篩選痛閾值在5～30s內的雌性小鼠（即痛閾合格的小鼠）80只，分組及給藥劑量見“1.4”，每日1次，連續灌胃7d。首次給藥前，在熱板儀上重復測量兩次痛閾值，平均值作為各組小鼠的基礎痛閾值。給藥后1h、1.5h、2h再測各組小鼠痛閾值，若小鼠痛閾值超過60s，應立刻將小鼠取出或停止熱板實驗，此時痛閾值按60s計算。

2.4 扭體法

取小鼠80只，分組及給藥劑量見“1.4”，每日1次，連續灌胃7d，于末次給藥1h后，各組小鼠分別腹腔注射1.5%的冰乙酸0.2ml，觀察并記錄小鼠從注射冰乙酸后第一次出現扭體反應（小鼠腹部收縮內凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行）的時間（即扭體潛伏期）和注射15min內小鼠的扭體反應次數[4，5]，并按下列公式計算扭體抑制率。

扭體抑制率（%）=（空白對照組小鼠扭體次數-給藥組小鼠扭體次數）/空白對照組小鼠扭體次數×100%

2.5 雞蛋清致大鼠足腫脹法

取SD大鼠72只，分組及給藥劑量見“1.4”，每日1次，連續灌胃7d，于末次給藥1h后，在大鼠右后足掌中心皮下注射10%雞蛋清生理鹽水溶液0.1ml造急性炎癥模型，分別在致炎前和致炎后0.5h、1h、2h測量并記錄各大鼠右后足趾固定位置的厚度，按下列公式計算足腫脹度[6]。

足腫脹度（cm）=致炎后足趾厚度（cm）-致炎前足趾厚度（cm）

2.6 二甲苯致小鼠耳腫脹法

取小鼠80只，分組與給藥劑量見“1.4”，每日1次，連續灌胃7d，于末次給藥1h后，于小鼠左耳正反面均勻涂抹二甲苯0.05mL致炎，右耳不涂二甲苯。致炎0.5h后，將小鼠處死，剪下小鼠的左右兩耳，在左耳致炎的部位和右耳同一位置做好標記，用打孔器在做好標記的位置上打下圓耳片，隨即用電子天平精密稱量左右圓耳片的重量，記錄并計算小鼠耳廓腫脹度和腫脹度抑制率[7]。

腫脹度（mg）=左耳重量（mg）-右耳重量（mg）

腫脹抑制率（%）=（空白對照組小鼠耳腫脹度-給藥組小鼠耳腫脹度）/空白組小鼠耳腫脹度×100%

2.7 統計學分析

采用spss25.0軟件進行統計學分析，數據以均數加減標準差（x±s）表示，組與組之間的比較采用方差分析法處理。

3 實驗結果

3.1 響應面法優化赤瓟子提取工藝

根據Box-Behnken中心組合設計，采用響應面法確定出了蒙藥赤瓟子的浸膏提取率最高的條件，即最佳提取工藝為：液料比、乙醇的濃度、提取的時間、提取的溫度分別為15：1ml/g、68%、1h、80℃。

3.2 對小鼠痛閾值的影響

赤瓟子乙醇提取物對小鼠痛閾值的影響結果見表1。研究結果表明，與空白對照組相比，CPZE中劑量組和陽性對照組小鼠的痛閾值隨著時間的推移顯著增加（P<0.01），而CPZE低劑量組和高劑量組小鼠的痛閾值顯著增加（P<0.05）。與陽性對照組相比，CPZE中劑量組小鼠的痛閾值差異具有顯著性（P<0.01），雖然CPZE比阿司匹林的鎮痛活性略低，但仍然表現出較強的鎮痛活性。CPZE的鎮痛強度與劑量呈一定相關性，即在一定范圍內，CPZE的鎮痛強度隨著劑量的增加而增大。由表1可知，各組小鼠（空白對照組除外）痛閾值均在1.5h達到了峰值，換言之，1.5h CPZE的鎮痛活性最強，隨后各組小鼠痛閾值呈緩慢下降趨勢。

3.3 對冰乙酸誘發小鼠疼痛的影響

赤瓟子乙醇提取物對冰乙酸誘發小鼠疼痛的影響結果見表2。研究結果表明，與空白對照組相比，陽性對照組和CPZE高劑量組小鼠的扭體潛伏期延長顯著（P<0.01），扭體次數顯著降低（P<0.05）；CPZE中劑量組小鼠的扭體潛伏期顯著延長（P<0.05），扭體次數顯著減少（P<0.05）；CPZE低劑量組小鼠的扭體反應潛伏期沒有明顯變化，但該組小鼠扭體次數降低較為顯著（P<0.05）。從各組（空白對照組除外）對冰乙酸誘發小鼠疼痛的抑制率來看，陽性藥阿司匹林的抑制率最高，其扭體抑制率為61.86%，CPZE高劑量組、中劑量組的抑制率分別為55.37%和36.19%，CPZE低劑量組抑制率最低，抑制率只有19.43%，由此可知，鎮痛作用的強弱次序為：阿司匹林>赤瓟子高劑量組>赤瓟子中劑量組>赤瓟子低劑量組。由表2可知，一方面，CPZE的鎮痛強度隨著劑量的增加而逐漸增加，即呈現出一定的劑量依賴性；另一方面，CPZE高劑量組的鎮痛作用與阿司匹林相比，雖然有差距，但并不大。

3.4 對雞蛋清致大鼠足腫脹的影響

赤瓟子乙醇提取物對雞蛋清致大鼠足腫脹的影響實驗結果見表3。研究結果表明，與模型組相比，CPZE高、中、低劑量組和陽性對照組對大鼠足趾的局部炎癥均有顯著抑制作用（P<0.05/P<0.01），CPZE各劑量組和陽性對照組大鼠足腫脹程度明顯降低（P＜0.01），從0.5h以后均發揮了顯著的抗炎作用，且陽性對照組對大鼠炎癥的抑制活性最強；與空白組相比，模型組大鼠足腫脹度增加明顯（P＜0.01），從致炎0.5h后，各組大鼠足腫脹度均達到了峰值，隨后足腫脹度呈下降趨勢；在0.5h、1h、2h CPZE各劑量組對大鼠足趾腫脹均有明顯的抑制作用（P＜0.01），隨著劑量的增加，對炎癥的抑制作用越強，即抗炎強度呈現出劑量相關性。

3.5 對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

赤瓟子乙醇提取物對二甲苯所致的小鼠耳腫脹的影響結果見表4。由表4可知，與空白對照組相比，陽性對照組和CPZE高劑量組小鼠的耳腫脹度顯著降低（P＜0.01），CPZE中劑量組、低劑量組小鼠耳廓腫脹度變化也表現出明顯的差異性（P＜0.05），表明陽性對照藥和高劑量的CPZE能夠顯著緩解小鼠耳朵因涂二甲苯而引起的局部刺激性炎癥的癥狀，從而降低了小鼠的耳腫脹度。陽性對照組、CPZE高劑量組小鼠的耳腫脹抑制率位居前兩位，分別為58.34%和54.76%，二者無明顯差距（P＞0.05），這一結果不僅證明二者的抗炎活性較強，而且作用強度也相差無幾，CPZE中劑量組和低劑量組的小鼠耳腫脹抑制率分別為27.85%和19.37%，低于CPZE高劑量組和陽性對照組，二者差異具有統計學意義（P＜0.05），提示CPZE低劑量和中劑量小鼠的耳腫脹度雖有所下降，但不如阿司匹林和CPZE高劑量組，即抗炎活性遠低于阿司匹林和CPZE高劑量組。

4 討論

熱板法和扭體法是用于評價藥物鎮痛活性的經典實驗方法，前者用于評價藥物的中樞鎮痛活性，后者用于評價藥物的外周鎮痛活性[8]。熱板法系利用一定強度的溫熱刺激小鼠某一部位產生痛反應，熱刺激強度使皮溫度升高至45～55℃，低于45℃不會產生明顯痛覺，高于55℃會灼傷小鼠，因此控制好熱板溫度是實驗成敗的關鍵。扭體法系將一定體積和濃度的化學刺激性物質注入小鼠腹腔內，刺激臟層和壁層腹膜，引起深部較大面積較長時間的疼痛，該反應在注射15min內出現頻率高，該法缺點是缺乏一定特異性，因此必須輔助其他鎮痛實驗進行佐證[4]。本實驗通過熱板法和扭體法互相佐證、互為補充，使用兩種實驗方法不僅避免了單一實驗方法出現的缺陷和誤差，還能夠準確無誤地評價藥物的鎮痛活性。

小鼠耳腫脹法和大鼠足腫脹法作為篩選新抗炎藥物的經典實驗方法，具有操作簡單、方法可靠、差異性小、重現性高的特點。小鼠耳腫脹法的操作難點在于涂二甲苯的部位與取下的耳片要相吻合，否則會產生較大偏差，大鼠足腫脹法的操作難點在于足腫脹厚度的測定，為避免出現較大誤差，打耳片時提前在相應位置做好標記，測足腫脹厚度時采用數顯游標卡尺，保證了實驗數據的準確性和科學性。

蒙藥赤瓟子作為常用民族藥，在少數民族地區應用廣泛，其化學成分復雜，藥理活性多樣。據文獻報道，赤瓟子的化學成分主要有揮發油、皂苷、有機酸、香豆素、鞣質等[9，10]，赤瓟子不僅有鎮痛抗炎活性，還具有抑菌、解熱、免疫調節等藥理活性[11]，因此赤瓟子具有較大的藥用價值和廣闊的開發前景。目前，赤瓟子的用法用量主要依據典籍的記載和醫生的經驗，由于缺乏有效的數據支撐，用藥的安全性、有效性不能得到保證，這也限制了藥物的開發和應用。本研究證明CPZE在體內具有顯著的鎮痛抗炎活性，但CPZE的毒性、體外活性及作用機制尚未探明，這對全面推進赤瓟子的現代化進程至關重要，后續的研究將為蒙藥赤瓟子的臨床合理應用和藥物的開發利用提供更詳細、更全面、更科學的參考依據。

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