基于PI3K/AKT1 通路探討山西老陳醋對高脂飲食誘導大鼠抗氧化作用機制

申 彤，劉佳佳，陳 嘉，龐全海,

（1.山西農業大學動物醫學學院，山西晉中 030801；2.山西農業大學食品科學與工程學院（農產品貯藏保鮮研究所），山西太原 030031）

高脂血癥通常由長期高脂飲食所致，表現為外周血中脂質水平異常[1]，肝臟脂代謝紊亂，肝細胞變性[2]，可引發一系列心血管疾病[3]。山西老陳醋是中國傳統的全谷物固態發酵醋，發酵過程中形成了多酚、類黑素、益生菌等多種具有降脂抗氧化功效的有機物[4]。大量研究發現，山西老陳醋濃縮物可有效降低高脂血癥小鼠的血脂水平[5]，陳醋源乳桿菌通過改變肝臟脂肪酸的構成，改善高脂飲食大鼠肝脂質損傷[6]。進一步研究發現，山西老陳醋多酚提取物能有效減輕高脂血癥大鼠的血脂異常和氧化應激[7]。截止目前，山西老陳醋改善高脂血癥的作用機制及最適劑量范圍尚不明確。

調節糖脂代謝相關通路是最常見的高脂血癥防治手段[8]。研究表明脂代謝紊亂與磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）異常表達密切相關[9]。PI3K 是細胞代謝關鍵調節因子，PIK3CA是其催化亞基的一種，蛋白激酶B（Protein kinase B，Akt1）作為PIK3CA 的下游靶標響應激活[10]，PI3K/AKT1 信號轉導途徑通過調節甘油三酯合成關鍵酶的表達影響脂代謝[11]，抑制該通路可改善氧化應激損傷[12]，研究證實，食醋加工后的姜黃精油通過調節PI3K/AKT1 通路改善肝臟纖維化[13]。固態發酵醋多酚提取物通過抑制PI3K/AKT1 通路來調節脂代謝，減輕細胞氧化應激[14]。鑒于此，推測山西老陳醋可能通過調控PI3K/AKT1 通路相關基因表達，進而發揮預防高脂血癥發生和發展的作用。

本研究通過構建高脂血癥大鼠模型，并設置不同濃度山西老陳醋干預組，觀察其對大鼠血清內脂質及肝臟相關生化指標的影響，研究山西老陳醋通過PI3K/AKT1 通路對高脂飲食誘導大鼠發揮的降脂抗氧化作用，為后期進一步探究其調控機制提供一定的試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級雄性Wistar 大鼠 6 周齡，體重相近（170±20 g），斯貝福生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010，飼養于山西農業大學實驗動物中心（SYXK（晉）2020-0003），試驗動物使用方案嚴格執行山西農業大學試驗動物倫理委員會對動物試驗倫理的要求（IACUC 審查號：SXAU-EAW-2020SD02 01）；山西老陳醋 山西紫林醋業股份有限公司；玉米胚芽油 山東西王食品有限公司；吐溫-80（T8360）、膽固醇（C8280）、膽酸鈉（C1291697）、丙基硫氧嘧啶（P7161）、總RNA 提取試劑盒（R1200）、通用SP 檢測試劑盒（SP0041）、RIPA 組織/細胞裂解液（R0020）、BCA 蛋白濃度試劑盒（PC0020）、山羊抗兔二抗及山羊抗鼠二抗（SE134、SE132）Solarbio 公司；甘油三酯（Triglyceride，TG，A110-1-1）、總膽固醇（Total cholesterol，TC，A111-1-1）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C，A112-1-1）、谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT，C009-2-1）、谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST，C010-2-1）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP，A059-2）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR，A062-1-1）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD，A001-3）、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC，A015-2-1）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（R323）

諾唯贊生物；2×Realtime PCR Super mix 試劑盒（MF013）北京聚合美生物科技有限公司；抗PIK3CA兔多克隆抗體（bs-2067R）、抗AKT1 兔多克隆抗體（bs-0115R）、抗GAPDH 鼠單克隆抗體（bsm-33033M）北京博奧森生物有限公司。

B11-3 恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；ELX808 全自動酶標儀 BioTek Instruments 公司；UV-1200 紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；NanoDrop One/OneC 核酸蛋白檢測儀 Thermo Fisher；T100 普通PCR 儀 美國Bio-Rad公司；LightCycler 96 熒光定量PCR 儀 Roche 生物科技有限公司；DYY-8C 電泳儀 北京六一生物科技有限公司；YD-6L 生物組織包埋機 金華市益迪醫療設備有限公司；DM4000 光學顯微鏡、RM2265輪轉式切片機 徠卡顯微系統（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同濃度山西老陳醋制備 山西老陳醋原醋為中濃度醋（2.7 g/（kg·bw））；蒸餾水稀釋至原體積2 倍即低濃度醋（1.35 g/（kg·bw））；恒溫50 ℃下使用磁力攪拌器將原醋濃縮至原體積1/2 即高濃度醋（5.4 g/（kg·bw））。

1.2.2 高脂飲食誘導大鼠模型構建 高脂乳劑由60%吐溫-80，15%玉米胚芽油，6%膽固醇，2%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶和16.8% H2O 配制而成（圖1），造模5 周[15]。

圖1 高脂乳劑制作流程Fig.1 Production process of high fat emulsion

1.2.3 試驗動物分組及樣品采集 選取30 只6 周齡健康狀況良好SPF 級大鼠，適應性飼喂1 周，根據每組間平均體重相近原則，隨機分為5 個試驗組（n=6）：正常組（C，常規飼料）、高脂模型組（M，高脂乳劑）、1.35 g/（kg·bw）陳醋干預M 組（LV）、2.7 g/（kg·bw）陳醋干預M 組（V）、5.4 g/（kg·bw）陳醋干預M 組（HV）。正常組各大鼠2.0 mL/d 生理鹽水持續灌胃10 周，試驗組高脂乳劑10 mL/kg·d 灌胃5 周后生理鹽水繼續灌胃5 周，山西老陳醋灌胃組各大鼠陳醋（2.0 mL/d）及高脂乳劑（10 mL/kg·d）灌胃5 周后使用陳醋繼續灌胃（2.0 mL/d）5 周。于溫度（22±2 ℃）、濕度（50%±5%）標準動物房內常規飼料喂養，自由采食。

11 周試驗結束后，禁食16 h，乙醚麻醉，腹主動脈采血，全血樣本室溫2 h，4 ℃ 2 h，3000 r/min 離心15 min，取血清于-80 ℃保存。采集各組大鼠同一位置肝臟組織，4%多聚甲醛固定，剩余組織-80 ℃保存。

1.2.4 不同試驗組大鼠血清中脂質含量、抗氧化及肝功能檢測 根據說明書，使用酶標儀和紫外分光光度計檢測各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C 含量，SOD、GR、T-AOC 酶活性，ALT、AST、AKP 的酶活力單位，M 組與C 組血脂含量（TC、TG、HDL-C）有統計學差異即為造模成功[16]。

1.2.5 不同試驗組大鼠肝臟組織病理學檢測 大鼠肝組織4%多聚甲醛固定24 h 后，取出修塊，經常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚度5 μm）后，蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，在200 倍光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.6 不同試驗組大鼠肝臟中PI3K/AKT1通路mRNA 水平表達檢測 根據NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）上檢索的大鼠PIK3CA、AKT1和GAPDHCDS 區，利用Primer Premier 3.0 分別設計3 對特異性引物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

總RNA 提取試劑盒提取各組大鼠肝臟總RNA，核酸蛋白檢測儀測定濃度和純度，根據HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR 說明書逆轉錄RNA 為cDNA。相對熒光定量法（qRT-PCR）檢測大鼠肝臟中PIK3CA、AKT1mRNA 表達，根據2×Realtime PCR Super mix試劑盒說明構建反應體系（20 μL）：2×Realtime PCR Super mix 10 μL、cDNA 模板2.0 μL、正反向引物各0.5 μL、ddH2O 7.0 μL，每個指標重復3 次；設置反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環40 次；72 ℃ 5 min。利用2-ΔΔCT法計算不同實驗組大鼠肝臟中PIK3CA及AKT1mRNA水平表達。

1.2.7 不同實驗組大鼠肝臟中PI3K/AKT1 通路蛋白水平表達檢測 使用組織裂解液（含PMSF）提取不同試驗組大鼠肝臟組織總蛋白，4 ℃ 14000 r/min離心10 min，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。SDSPAGE 電泳時，上樣量為50 μg/孔，100 ℃水浴變性5 min，按照10%分離膠80 V 20 min，5%濃縮膠120 V 60 min 電泳，200 mA 60 min 恒流濕轉至NC膜，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，TBST 洗膜5 次，抗PIK3CA 兔多克隆抗體及抗AKT1 多克隆抗體（1:300）、抗GAPDH 鼠單克隆抗體（1:5000）4 ℃孵育過夜（12～16 h），移去一抗，山羊抗鼠二抗及山羊抗兔二抗（1:15000）室溫孵育1 h，TBST 漂洗5 次，ELC Plus 超敏發光液顯色，ImageJ 8.0 分析蛋白免疫印跡灰度值。

1.2.8 不同試驗組大鼠肝臟中PI3K/AKT1 通路定位分析 取前期烘干備用且組織完整的切片，按照通用SP 檢測試劑盒步驟依次進行脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，過氧化氫酶滅活，非特異性抗原位點封閉，抗PIK3CA 兔多克隆抗體及抗AKT1 多克隆抗體（1:100）4 ℃孵育過夜，復溫后，PBS 漂洗，室溫孵育二抗，PBS 漂洗，DAB 顯色，蒸餾水終止反應，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，常規脫水后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察，Image-Pro Plus 6.0 進行光密度值分析。

1.3 數據處理

使用Graphpad Prism 8.3.0 分析作圖，所有數據以平均數±標準差（±SD）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立t檢驗。P<0.01 作為差異極顯著的界值，P<0.05 作為差異顯著的界值。

2 結果與分析

2.1 不同試驗組大鼠血清中脂質含量、抗氧化活性及肝損傷指標檢測結果

2.1.1 血清脂質含量檢測結果 高脂飲食會導致大鼠體內脂質過度沉積，脂代謝紊亂，引發高脂血癥，顯著特征是血清內TC，TG 含量升高，HDL-C 含量低于正常值[17]。如圖2 所示，與C 組相比，M 組TC 及TG 極顯著增加（P<0.01），HDL-C 極顯著降低（P<0.01），說明，高脂血癥大鼠模型構建成功[16]；與M 組相比，HV、MV 和LV 組TC 及TG 均極顯著降低（P<0.01），HDL-C 極顯著升高（P<0.01）；與LV 組相比，HV 和MV 組TC 及TG（極）顯著降低（P<0.05，P<0.01），HDL-C 極顯著升高（P<0.01）；與MV 組相比，HV 組HDL-C 顯著升高（P<0.05），TC、TG 差異不顯著（P>0.05），結果表明，不同劑量山西老陳醋均可改善高脂飲食引起的脂代謝紊亂，中高劑量組改善效果優于低劑量組。

圖2 各組大鼠血脂變化情況Fig.2 Changes in blood lipids of rats in each group

2.1.2 抗氧化酶活性檢測結果 血清內脂質升高，會導致氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）增加，使機體發生一定程度的脂質過氧化，T-AOC 表示機體內總抗氧化能力，SOD 和GR 是氧自由基清除劑[18]。如圖3 所示，與C 組相比，M 組SOD、GR 及T-AOC 均極顯著降低（P<0.01），說明脂質堆積使大鼠機體抗氧化酶系統紊亂；與M 組相比，HV、MV和LV 組SOD 和T-AOC 均（極）顯著升高（P<0.05，P<0.01），MV 和HV 組GR 極顯著升高（P<0.01），LV 組GR 無顯著差異；與LV 相比，HV 組SOD 及GR 均極顯著升高（P<0.01），MV 組T-AOC 和GR（極）顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與MV 組相比，HV 組SOD 極顯著升高（P<0.01），T-AOC 極顯著降低（P<0.01），GR 無顯著差異（P>0.05），結果表明，山西老陳醋可提高機體抗氧化能力，降低高脂飲食大鼠氧化應激水平。

圖3 各組大鼠血清內抗氧化酶活性Fig.3 Antioxidant enzyme activities in serum of rats in each group

2.1.3 肝損傷指標檢測結果 血清內ALT 和AST含量升高是肝細胞受損的重要標志，AKP 含量和肝損傷的程度呈負相關[19]。如圖4 所示，與C 組相比，M 組ALT 及AST 均極顯著升高（P<0.01），AKP 極顯著降低（P<0.01），說明血脂過高使肝細胞受損，使細胞質內ALT 和AST 釋放至血液內[20]，AKP 合成減少；與M 組相比，HV、MV 和LV 組ALT 及AST均極顯著降低（P<0.01），AKP 均極顯著升高（P<0.01）；與LV 組相比，MV 和HV 組ALT 及AST 均（極）顯著降低（P<0.05，P<0.01），AKP 極顯著升高（P<0.01）；與MV 組相比，HV 組AST 極顯著降低（P<0.01），ALT 及AKP 無顯著差異（P>0.05），結果表明，山西老陳醋對肝臟具有一定保護作用，可有效減輕高脂飲食誘發的肝脂質損傷。

圖4 各組大鼠血清內肝功能指標Fig.4 Serum liver function indexes of rats in each group

2.2 肝臟組織病理學檢測結果

HE 染色結果顯示（圖5），與C 組相比，M 組肝索排列紊亂，肝細胞脂肪變性及空泡樣變增多，肝細胞腫脹，細胞核移位，胞漿內出現致密且較大的脂滴空泡；與M 組相比，LV 組、MV 組、HV 組細胞變性及脂滴空泡明顯減少，HV 組和MV 組干預效果優于LV 組，結果表明，山西老陳醋可有效改善大鼠肝臟脂肪蓄積現象，緩解肝組織病變。

圖5 各組大鼠肝臟組織HE 染色結果（20×）Fig.5 HE staining results of liver tissue of rats in each group (20×)

2.3 山西老陳醋對各組大鼠PIK3CA、AKT1 mRNA水平表達的影響

qRT-PCR 檢測結果顯示（圖6），與C 組相比，M 組PIK3CA及AKT1mRNA 水平表達均極顯著升高（P<0.01），說明大鼠脂代謝異常導致肝臟內PI3K/AKT1 信號傳導通路被激活；與M 組相比，LV、MV 和HV 組PIK3CA及AKT1mRNA 水平表達均極顯著降低（P<0.01）；與LV 組相比，MV 和HV 組PIK3CA及AKT1mRNA 水平表達均極顯著降低（P<0.01）；與MV 組相比，HV 組PIK3CA及AKT1mRNA 水平表達無顯著差異（P>0.05），結果表明，山西老陳醋可顯著改善高脂飲食誘發大鼠肝臟內PIK3CA及AKT1基因表達異常。

圖6 各組大鼠肝臟PIK3CA 及AKT1 mRNA 相對表達量Fig.6 Relative expression levels of PIK3CA and AKT1 mRNA in liver of rats in each group

2.4 山西老陳醋對各組大鼠PIK3CA、AKT1 蛋白水平表達的影響

Western blotting 檢測結果顯示（圖7），與C 組相比，M 組PIK3CA 及AKT1 蛋白表達均極顯著升高（P<0.01），說明肝脂質蓄積使大鼠肝臟內PIK3CA及AKT1 蛋白表達異常；與M 組相比，HV、MV 和LV 組PIK3CA 及AKT1 蛋白表達極顯著降低（P<0.01）；與LV 組相比，HV 和MV 組PIK3CA 及AKT1蛋白表達均極顯著降低（P<0.01）；與MV 組相比，HV 組PIK3CA 蛋白表達極顯著降低（P<0.01），AKT1 表達無顯著差異（P>0.05），結果表明，山西老陳醋可有效抑制高脂血癥大鼠肝臟內PIK3CA 及AKT1 蛋白表達。

圖7 各組大鼠肝臟PIK3CA 及AKT1 蛋白相對表達量Fig.7 Relative expression levels of PIK3CA and AKT1 proteins in liver of rats in each group

2.5 山西老陳醋對各組大鼠PIK3CA、AKT1 定位的影響

免疫組化分析結果顯示（圖8），各組大鼠肝臟細胞核和細胞質中均有PIK3CA 和AKT1 表達，與C 組相比，M 組PIK3CA 及AKT1 表達極顯著升高（P<0.01）。與M 組相比，HV、MV 和LV 組PIK3CA及AKT1 表達極顯著降低（P<0.01），與LV 組相比，HV 和MV 組PIK3CA 與AKT1 表達（極）顯著降低（P<0.05，P<0.01），結果表明，山西老陳醋通過抑制大鼠肝臟PIK3CA 及AKT1 的表達進而調控PI3K/AKT1 通路。

圖8 PIK3CA、AKT1 免疫組化結果及光密度分析（20×）Fig.8 IHC results and optical density analysis of PIK3CA and AKT1 (20×)

3 討論與結論

目前，高脂血癥的治療主要以中藥和膳食輔助治療為主[21]，山西老陳醋富含多種活性物質，可調節血脂保護肝臟[22]。研究證實，山西老陳醋可以降低醉酒小鼠肝功酶活性[19]，提取的多酚通過抑制TC、TG 分泌調節脂代謝[23]。本次研究中，高脂血癥大鼠體內PI3K/AKT1 信號轉導途徑被激活，不同劑量山西老陳醋均可抑制該通路。PI3K/AKT1 通路參與膽固醇的攝入與轉導，調控該通路及其下游脂質合成基因表達[11]，可調節脂代謝。研究結果表明，山西老陳醋可能通過下調PIK3CA 及AKT1 基因和蛋白的表達，改善高脂飲食誘發的血脂水平、肝功酶活性異常和肝臟病理性損傷，且濃度為2.7 和5.4 g/（kg·bw）山西老陳醋對血脂、肝功酶水平異常和肝脂肪性病變改善效果均優于1.35 g/（kg·bw）低劑量干預組，中高劑量組改善效果無顯著差異。

高脂血癥通常伴隨著氧化應激的發生，高脂飲食誘導脂質積累，肝臟脂代謝紊亂[24]，游離脂肪酸堆積，肝細胞脂肪變性，抗氧化酶系統紊亂，過量產生的ROS 無法被清除，引發氧化應激損傷[25]，研究證實山西老陳醋多酚類提取物具有強抗氧化活性[26]，陳醋源類黑素通過調控AKT 信號傳導途徑影響ROS生成[27]。本次研究結果表明，山西老陳醋通過提高抗氧化酶活性，增加大鼠抗氧化能力。PI3K/AKT1 信號轉導途徑與多種細胞氧化應激密切相關[28]，可通過調節ROS 的生成調節氧化應激[29]，進一步研究發現多種活性物質均可通過抑制PI3K/AKT1 的表達來改善氧化應激[30-31]，本次研究結果顯示，干預組大鼠肝臟內PIK3CA 及AKT1 在基因和蛋白水平上均顯著下降，說明山西老陳醋改善氧化應激可能是通過抑制PI3K/AKT1 的表達來實現的，且2.7 g/（kg·bw）和5.4 g/（kg·bw）山西老陳醋干預組抗氧化及抑制PI3K/AKT1 通路能力最為顯著。進一步研究發現山西老陳醋濃縮物的降脂作用，優于陳醋原液[5]。這可能是由于山西老陳醋內富含的有機物均具有揮發性[32]，濃縮過程中以乙酸為主的有機酸[33]和黃酮類物質損失量最大[34]，且本研究中，高劑量組濃度及大鼠攝入量均高于前人研究，綜上推測，山西老陳醋的最適濃度可能在2.7～5.4 g/（kg·bw）之間。

綜上，不同劑量山西老陳醋均可改善高脂血癥大鼠的脂代謝紊亂和氧化應激損傷，高脂飲食誘導大鼠體內PI3K/AKT1 通路高度活化，山西老陳醋干預下肝臟內PI3K/AKT1 通路受到不同程度抑制，濃度為2.7～5.4 g/（kg·bw）山西老陳醋改善效果最佳。由此，本研究推測山西老陳醋可能通過抑制PI3K/AKT1 通路，進而改善高脂血癥大鼠抗氧化應激和脂代謝紊亂的能力，但其靶向抑制PI3K/AKT1 信號通路的機制尚不明確，有待進一步研究。