康樂黃雞肌肉生長抑制素基因多態性對上市日齡體重的遺傳效應分析

謝欣怡，陳俊赫，王文浩

(1.山東農業大學生命科學學院，山東 泰安 271018；2.江蘇農牧科技職業學院動物科技學院，江蘇 泰州 225300)

肉品質受許多因素的影響，主要有環境和遺傳兩個大的方面。肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)，是動物體內一種重要的轉化生長因子，該基因起源于轉化生長因子-β(TGF-β)超家族[1]。該基因包含3個外顯子和2個內含子，其前體由375個氨基酸組成[2]。它主要存在于肌肉組織中，在肌肉生長中發揮著重要的負調節作用，參與調節骨骼生長和脂肪沉積及代謝，甚至對肌腱和韌帶的強硬度有一定影響[3-4]。該基因發生突變，可能導致肌細胞的過度生長以及肌纖維的肥大，直接影響畜禽生長性能。有研究表明，家畜由于該基因缺失或突變，可能表現出十分發達的“雙肌性狀”[5]。G→A突變錯譯是皮埃蒙特牛產生“雙肌”現象的原因之一，由于機體基因表達的變化，不能合成正常的MSTN蛋白，導致體重增加[6]。Xu等[7]發現小鼠缺乏MSTN基因，肌肉明顯增加，體重比野生小鼠大1倍。豬敲除MSTN基因后，除了能增加肌肉的質量外，隨著年齡的增長，脂肪含量會明顯降低[8]。研究還發現比利時藍牛因MSTN基因發生移碼突變，在缺失堿基后的第14個密碼子開始，停止翻譯[8]。Lee等[9]研究發現，當中年小鼠缺失MSTN基因后，肌肉增加顯著，脂肪含量呈大幅度下降，這表明通過敲除MSTN基因可以減輕由于衰老引起的病理癥狀。

康樂黃雞原產于江西省宜春市萬載縣康樂鎮，有著1 500多年的養殖歷史，表觀特點是“腳黃、毛黃、皮膚黃”，易于飼養管理，溫順，耐粗飼，鮮嫩肉味[10-11]。目前關于康樂黃雞MSTN基因的單核苷酸多態性(SNP)位點及其遺傳表達規律、作用機制等研究尚未見報道。本試驗旨在探討康樂黃雞MSTN基因第一外顯子區域SNP，采用全血基因組提取和分子生物學的方法，對康樂黃雞MSTN基因進行PCR擴增、測序、分析變異情況，研究其對康樂黃雞上市體重性狀的遺傳效應，篩選出優良基因(分子標記)，為這一優良地方雞種資源的保護以及開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為180日齡生長狀況良好的康樂黃雞母雞，試驗樣本量為200，飼養于宜春學院生態養殖基地。采用常規翅下靜脈采血的方法，在無菌環境下操作，加入檸檬酸葡萄糖溶液(ACD)抗凝劑，制成1.5 mL抗凝血液，-20 ℃下保存備用。同時稱取180 d上市體重，用于后續關聯分析。

1.2 主要試劑

引物，抗凝劑ACD，耐熱DNA聚合酶(Taq酶)，10 mmol/L的Tris-HCl Buffer，dNTPs，瓊脂糖，DNA裂解液，75%乙醇，冰醋酸，氯仿-異戊醇(24∶1)，氨基丁三醇(Tris)，HCl，氨基丁三醇-乙二胺四乙酸(TE)溶液，3 mol/L 醋酸鈉(pH=5.2)，異丙醇，TAE溶液，甘油上樣緩沖液，核染料，0.1%巰基乙醇，0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)等試劑，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 康樂黃雞血液采集及基因組DNA提取

對受試雞進行DNA采集，采集雞翅靜脈血1 mL，并用ACD抗凝劑處理，存放于-20 ℃冰箱備用。采用天根生化科技(北京)有限公司血液基因組DNA提取試劑盒對試驗雞血液基因組DNA進行抽提，隨后以超微量紫外分光光度計檢測其濃度及質量。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳測定基因組

取DNA溶液5 μL，加入5 μL甘油上樣緩沖液(已加核染)混勻，滴入點樣孔點樣。在90 V電壓，60 mA左右電流下，電泳50 min，使用Image Lab核酸凝膠成像系統成像，觀察條帶分布并分析電泳結果。

1.5 設計MSTN基因引物

依據GenBank中cDNA文庫所提供的雞MSTN基因序列，在Primer 5.0軟件中設計上下游引物。預計擴增片段大小為495 bp。引物序列為，MSTN-1s：5′-TTGCATTTGCAGTCACGGAT-3′；MSTN-1a：5′-ACGAAAGCAGCAGGGTTGTT-3′。

M. DNA Marker DL5000；1、2. 雞基因組DNA；3.MSTN基因PCR擴增產物；紅色標記為系統自動加強。圖1 全血DNA與MSTN基因PCR擴增產物電泳

1.6 PCR擴增

PCR反應體系25 μL：18.0 μL ddH2O，2.0 μL dNTPs(10 μmol/L)，2.5 μL含有Mg2+的buffer(10 μmol/L)，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),模板DNA 1 μL，Taq酶 0.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共32個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Image Lab核酸凝膠成像系統觀察分析電泳結果，拍照保存[12]。

1.7 數據統計與分析

利用SPSS 22.0軟件進行群體等位基因頻率分析、基因型頻率分析、哈代溫伯格平衡檢驗等，數據表示為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 全血基因組電泳分析

Image Lab核酸凝膠成像系統顯示目的條帶明顯清晰，分布集中，無彌散分離、拖尾、出現多重條帶等不良現象(見圖1A)，表明DNA提取成功，全血基因組完整，可用作后續PCR擴增模板。

2.2 擴增片段的電泳分析

使用Image Lab核酸凝膠成像系統分析PCR擴增MSTN基因的條帶，結果如圖1B所示。目的條帶清晰明顯，具有較強的特異性，產物片段大小在500 bp左右，符合預期，可用于后續分析。

2.3 擴增片段測序結果及比對分析

將擴增產物送于測序公司(安徽滁州通用生物公司)進行純化，并雙端測序，將測序結果與基因庫中MSTN序列(GenBank登錄號：NC_052538)進行BLAST在線比對，PCR擴增產物相似度超過99%，說明 PCR擴增產物的序列與目標序列相同。使用Chromas軟件分析堿基突變情況，結果表明第一外顯子中存在1個SNP位點，該突變位于7號染色體上252 542 bp處，該位點發生的突變是C→G突變(圖2)。

2.4 不同基因型對康樂黃雞體重的遺傳效應分析

經過測序得到MSTN基因1個C→G突變，其中C、G等位基因頻率以及其包含的3個基因型頻率見表1。MSTN基因經哈代溫伯格平衡檢驗，該群體χ2為1.03，該群體處于平衡狀態。將試驗的200個個體不同基因型上市日齡的康樂黃雞體重進行分類，分析不同基因型個體間體重的差異程度(表2)，結果表明突變純合子GG型的上市日齡體重顯著高于CC純合子以及CG雜合子(P<0.05)，CG與CC差異不顯著(P>0.05)。

表1 MSTN基因C→G突變等位基因頻率及基因型頻率

表2 不同基因型與上市日齡康樂黃雞體重性狀的關聯分析 g

3 討論

生長特性一般受微效應多基因控制，微效多基因不僅受單個多態位點的影響，且還受多態位點之間聚合效應的影響。研究發現，MSTN基因與皮下脂肪厚度、肌肉重量、屠宰率等性狀均有顯著關聯性[13-16]，而這些性狀正是影響雞上市體重性狀的主要因素。目前關于MSTN基因SNP位點的研究有許多，包括豬、牛、羊、雞等均有涉及。在雞上研究發現MSTN基因突變對其生產性能的影響主要集中在第一外顯子上：李維等[17]對赤水烏骨雞 MSTN 基 因的外顯子進行多態性檢測，結果發現在赤水烏骨雞MSTN基因的外顯子1中檢測到1個SNP位點C324T，得出MSTN基因對赤水烏骨雞 pH 值和剪切力具有較大的遺傳效應的結論；龍廣麗等[18]在貴州地方白羽雞種MSTN基因的第一外顯子處篩查到6個SNPs，其中4個SNPs位點突變會導致基因mRNA二級結構的構象發生改變，可作為改良貴州地方白羽雞肉質品質的分子遺傳標記進一步研究；張賢嫻等[19]研究發現，大恒肉雞MSTN基因的第一外顯子序列上有5個SNPs位點，且其中的4個位點對肉雞的生長與與肉質有重要的影響；張麗等[20]以構建DNA混合池，通過分段擴增獲得靜寧雞MSTN基因編碼序列，并對其進行SNPs篩查和生物信息學分析的方法，發現靜寧雞MSTN基因編碼區全長1 128 bp，編碼375個氨基酸，該蛋白為親水性蛋白，編碼區共篩查到3個SNPs，均位于第一外顯子(exon1),分別為exon1-c.60G>A、exon1-c.195C>G和exon1-c.234G>A。本試驗對康樂黃雞MSTN進行了基因多態性檢測，篩選到的突變亦位于第一外顯子區域，與上述文獻吻合，該突變為C→G無義突變，通過突變體群里與原始群體的上市日齡體重比較分析發現突變純合子GG型的上市日齡體重顯著高于CC型和CG型，推測可能是由于該突變引起了基因組空間構像的改變，進而影響了基因的表達，最終影響了上市日齡的體重。該突變作為提高康樂黃雞上市日齡體重的一個潛在分子標記，可以借助目前已在雞上成功運用的基因編輯等新技術來進一步研究[21]。

4 結論

本試驗使用PCR擴增的方法，測定康樂黃雞MSTN基因的第一外顯子區域的堿基序列，結果表明該區域存在一個SNP位點。這個SNP位點突變純合子GG型的上市日齡體重顯著高于CC型和CG型，可以作為康樂黃雞后續品種改良潛在的候選分子標記，值得進一步研究。