阿托伐他汀對牙周炎大鼠的影響及可能機制

武 揚，李 麗

（山西白求恩醫(yī)院/同濟山西醫(yī)院/山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，太原 030002）

牙周炎是臨床常見的口腔疾病，好發(fā)于35 歲以上人群，發(fā)病率隨年齡的增長而升高，可導(dǎo)致牙齦紅腫、出血、牙周囊袋形成、牙槽骨吸收及牙齒松動等口腔問題[1]。目前，牙周炎的治療主要包括機械清創(chuàng)、藥物治療及外科手術(shù)等方式，通過清除牙周囊袋內(nèi)牙菌斑及牙結(jié)石，使用抗生素等藥物控制感染，或徹底清除深部感染灶，重建牙周組織生理結(jié)構(gòu)和功能，但難以徹底清除全部細菌，且存在易復(fù)發(fā)、手術(shù)創(chuàng)傷大及恢復(fù)緩慢等問題，無法完全阻止或逆轉(zhuǎn)牙槽骨吸收[3]。阿托伐他汀（atorvastatin，ATV）是一種廣泛應(yīng)用于高膽固醇血癥及心血管病預(yù)防的藥物，近年來發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化及促進骨形成等多種生物學(xué)效應(yīng)[4-5]。ATV 能夠改善牙周炎患者臨床指標，減少牙周組織中炎性細胞因子水平及牙周袋深度[6]。但ATV 對牙周炎牙槽骨吸收情況的影響及可能機制尚不清楚。本研究通過建立牙周炎大鼠模型，觀察ATV 對其牙槽骨吸收及炎癥反應(yīng)的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

62 只SD 大鼠，SPF 級，雄性，8 周齡，體質(zhì)量（300±20）g，購自上海昇敞生物科技有限公司，生產(chǎn)許可SCXK（滬）2021-0002。大鼠在12 h/12 h光暗循環(huán)、溫度（22±2）℃、濕度（55±5）%的條件下飼養(yǎng)，自由進食和飲水。實驗前1 周進行適應(yīng)性喂養(yǎng)。本研究獲院倫理委員會批準（倫理批號：2023078-J356）。

1.2 藥物、主要試劑與儀器

阿托伐他汀鈣片，輝瑞制藥有限公司，規(guī)格：每片20 mg，批準文號：國藥準字H20051408；無翅型MMTV 整合位點家族蛋白（Wnt）/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路抑制劑XAV939，美國TargetMol公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-17（IL-17）、白介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，上海遠慕生物科技有限公司；兔抗大鼠β-catenin、p-β-catenin、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）一抗，日本MBL 公司。

錐形束CT（CBCT）掃描儀，意大利NewTom VGi 公司；SZX10 顯微鏡，日本OLYMPUS 株式會社；Doc EZ 凝膠成像分析系統(tǒng)，美國伯樂公司。

1.3 構(gòu)建牙周炎大鼠模型

腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥位固定于手術(shù)架，用無菌手術(shù)刀在大鼠左上頜第一磨牙和第二磨牙之間的牙齦上切開1 個約3 mm 長的口，將1根4-0 絲線穿過口中，沿著牙頸部縫合，使絲線緊貼牙面，形成1 個牙周袋。右上頜第一磨牙和第二磨牙之間的牙齦上進行同樣的操作。結(jié)扎后每天更換1 次絲線，以維持牙周炎持續(xù)性。以建模結(jié)扎8周后，牙齦紅腫、探診出血及牙周袋形成為造模成功標準[7]。

1.4 干預(yù)方式及分組

從62 只大鼠中隨機選取15 只不做處理，設(shè)為健康組，其余47 只構(gòu)建牙周炎模型，成功45 只，隨機分為牙周炎組、ATV 組、聯(lián)合組，各15 只。建模成功后，ATV 組大鼠灌胃阿托伐他汀鈣生理鹽水溶液5 mL（含阿托伐他汀鈣3 mg·kg-1）[8]，1 h 后腹腔注射二甲基亞砜（DMSO）溶液0.2 mL；聯(lián)合組大鼠灌胃阿托伐他汀鈣生理鹽水溶液5 mL（劑量3 mg·kg-1），1 h 后腹腔注射XAV939 DMSO 溶液0.2 mL（劑量20 mg·kg-1）[9]；健康組、牙周炎組大鼠灌胃生理鹽水溶液5 mL，1 h 后腹腔注射DMSO 溶液0.2 mL，每日1 次，持續(xù)干預(yù)4 周。

1.5 檢測牙周炎相關(guān)指標

末次干預(yù)后檢測。牙齦出血指數(shù)（SBI）：將每顆牙分為近中頰側(cè)、近中舌側(cè)、遠中頰側(cè)、遠中舌側(cè)、中間頰側(cè)、中間舌側(cè)6 個區(qū)域，用探針沿著齦溝插入約1 mm 深度，輕輕刮動后拔出，觀察有無出血，并按照以下標準進行評分：0 分，無出血；1 分，探針拔出后有點狀出血；2 分，探針拔出后有線狀出血；3 分，探針拔出后有大片出血或自發(fā)性出血。菌斑指數(shù)（PLI）：棉簽蘸取2%堿性品紅滴至建模牙齒處，30 s 后蒸餾水沖洗，將每顆牙分為近中、遠中、頰側(cè)、舌側(cè)或腭側(cè)4 個區(qū)域，用探針輕觸牙面，以紫紅色面積及深淺程度判斷是否出現(xiàn)菌斑，并按照以下標準進行評分：0 分，無菌斑；1 分，牙頸部有細小菌斑，僅用探針或鏡片才能發(fā)現(xiàn)；2 分，牙頸部有中等量的菌斑，肉眼可見；3 分，牙頸部有大量的菌斑，覆蓋整個牙面。

1.6 檢測血清TNF-α、IL-17、IL-10水平

末次干預(yù)后，各組大鼠均禁食12 h，麻醉后抽取腹主動脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清TNF-α、IL-17、IL-10 水平。將動脈血樣品按照說明書稀釋比例加入預(yù)先包被有TNF-α、IL-17、IL-10特異性抗體微孔板中，在37℃下孵育2 h，去除液體并洗滌5 次，加入生物素標記的TNF-α、IL-17、IL-10 特異性二抗，在37℃下孵育1 h，去除液體并洗滌5 次，加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，在37℃下孵育30 min，去除液體并洗滌5 次，加入底物溶液，在室溫下孵育15 min，加入終止液，用酶標儀（450 nm 波長）測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計算樣本濃度。

1.7 CBCT 觀察牙槽骨吸收情況

取血后，每組大鼠隨機選擇5 只頸椎脫臼處死，10%中性緩沖甲醛溶液固定大鼠下頜，修正標本后將下頜置于CBCT 掃描儀中，采用以下參數(shù)進行掃描：管電壓110 kV，管電流3 mA，層厚0.3 mm，像素尺寸0.125 mm。利用NNT 軟件對掃描圖像進行重建和分析，測量骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp），以及下頜第一磨牙遠中根的牙槽骨高度，即從釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂?shù)木嚯x（CEJ-AC）。由2 名經(jīng)過培訓(xùn)的觀察者獨立進行測量，重復(fù)3 次，取平均值。

1.8 HE 染色觀察牙周組織形態(tài)學(xué)變化

每組剩余大鼠隨機選擇5 只頸椎脫臼處死，并取建模牙及其周圍牙周組織，分成2 份，1 份固定在10%中性緩沖甲醛溶液中24 h，采用10% EDTA脫鈣液脫鈣，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，厚度為5 μm，采用HE 染色法對切片進行染色，用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照；1 份投入液氮中保存。利用Image-Pro Plus 軟件分析圖片，測量下頜第一磨牙遠中根的上皮附著喪失量，即從牙槽嵴頂?shù)缴掀じ街c的距離。由2 名經(jīng)過培訓(xùn)的觀察者獨立進行測量，重復(fù)3 次，取平均值。

1.9 免疫印跡法檢測檢測牙周組織β-catenin 、p-βcatenin 、GSK-3β、Runx2蛋白表達量

取液氮凍存牙周組織，超聲波破碎后，勻漿、裂解，注入離心管內(nèi)提取總蛋白，采用Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離后，轉(zhuǎn)印到聚氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶在室溫下孵育1 h 以封閉非特異性結(jié)合位點，TBST 清洗，用β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β、Runx2 的特異性兔多克隆抗體（1:500 稀釋）在4℃下過夜孵育，TBST 清洗，碘化半胱氨酸標記的羊抗兔二抗（1:2 000 稀釋）在室溫下孵育1 h，用增強型化學(xué)發(fā)光法檢測信號，并用GAPDH 作為內(nèi)參。用圖像分析軟件Image-Pro Plus 測量各條帶灰度值，并計算其相對表達量（目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值）。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用IBM SPSS 24.0 分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標準差（±s）描述計量資料，以單因素方差分析比較多樣本計量資料，以LSD-t檢驗比較兩兩樣本。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠SBI、PLI比較

見表1。

表1 各組大鼠SBI、PLI 比較（±s ，n= 15） 分

表1 各組大鼠SBI、PLI 比較（±s ，n= 15） 分

注：與健康組比較，# P ＜0.05；與牙周炎組比較，△P ＜0.05；與ATV 組比較，▲P ＜0.05

組別SBIPLI健康組0.18±0.020.17±0.04牙周炎組1.40±0.19#1.56±0.23#ATV 組0.55±0.07△0.68±0.07△聯(lián)合組0.79±0.12▲1.02±0.38▲

2.2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s ，n= 15）

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s ，n= 15）

注：與健康組比較，# P ＜0.05；與牙周炎組比較，△P ＜0.05；與ATV 組比較，▲P ＜0.05

組別TNF-α/（ng·mL-1）IL-17/（pg·mL-1）IL-10/（pg·mL-1）健康組 71.15±10.33 4.33±0.579.98±2.35牙周炎組285.47±52.14#15.35±2.49#2.42±0.37#ATV 組129.93±24.52△ 9.12±1.26△5.20±0.78△聯(lián)合組177.09±22.15▲13.86±3.35▲3.06±0.92▲

2.3 各組大鼠牙槽骨吸收指標比較

見表3。

表3 各組大鼠牙槽骨吸收指標比較（±s ，n= 5）

表3 各組大鼠牙槽骨吸收指標比較（±s ，n= 5）

注：與健康組比較，# P ＜0.05；與牙周炎組比較，△P ＜0.05；與ATV 組比較，▲P ＜0.05

組別Tb.Th/mmTb.N/（個/mm）Tb.Sp/mmCEJ-AC/mm健康組0.19±0.045.23±0.780.12±0.031.07±0.19牙周炎組0.07±0.02#4.02±0.53#0.25±0.08#2.51±0.47#ATV 組0.14±0.15△4.96±0.46△0.16±0.04△1.93±0.18△聯(lián)合組0.10±0.03▲4.05±0.08▲0.20±0.05▲2.25±0.26▲

2.4 牙周組織病理改變

HE 染色顯示，對照組牙周膜及牙齦上皮結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，牙周組織細胞形態(tài)正常，膠原纖維排列緊密，未出現(xiàn)牙槽骨吸收現(xiàn)象及炎癥細胞；模型組牙齦上皮結(jié)構(gòu)嚴重破壞，上皮組織糜爛，膠原纖維變性斷裂，牙槽骨內(nèi)出現(xiàn)明顯吸收凹陷，可見大量炎癥細胞彌散狀分布，深牙周袋形成，牙槽嵴頂?shù)接匝拦琴|(zhì)界間距增大；與模型組比較，ATV 組、聯(lián)合組牙槽骨形態(tài)得以改善，炎癥細胞數(shù)量減少，偶見部分新生膠原纖維。與聯(lián)合組比較，ATV 組牙周損傷改善更為顯著。見圖1。

圖1 牙周組織病理改變（HE 染色，×400）

2.5 各組牙周組織GSK-3β、Runx2蛋白表達量，p-β-catenin/β-catenin 比較

見表4，圖2。

表4 各組牙周組織GSK-3β、Runx2蛋白表達量，p-β-catenin/β-catenin 比較（±s，n = 5）

表4 各組牙周組織GSK-3β、Runx2蛋白表達量，p-β-catenin/β-catenin 比較（±s，n = 5）

注：與健康組比較，# P ＜0.05；與牙周炎組比較，△P ＜0.05；與ATV 組比較，▲P ＜0.05

組別p-β-catenin/β-cateninGSK-3βRunx2健康組0.81±0.230.09±0.020.83±0.11牙周炎組0.12±0.04#0.96±0.17# 0.20±0.05#ATV 組0.58±0.06△0.19±0.04△ 0.52±0.07△聯(lián)合組0.32±0.04▲0.41±0.06▲ 0.35±0.05▲

圖2 牙周組織β-catenin 、p-β-catenin 、GSK-3β、Runx2蛋白表達量

3 討論

吸煙、糖尿病、口腔衛(wèi)生習(xí)慣不佳、生活壓力、遺傳、牙齒不齊及女性激素變化等是牙周炎發(fā)病的主要危險因素。牙周炎發(fā)生和發(fā)展涉及口腔微生物、宿主過量免疫、炎癥反應(yīng)及骨吸收- 形成平衡失調(diào)等多個機制，牙槽骨吸收、過量炎癥反應(yīng)被認為是該病進展的主要原因[10-12]。牙周炎患者口腔內(nèi)存在大量致病菌，可刺激宿主產(chǎn)生TNF-α、白介素-17 等促炎因子，并抑制抑炎因子IL-10 分泌，可直接或間接增加細胞核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）表達，降低骨保護蛋白（OPG）水平，導(dǎo)致成骨細胞過度形成和活化。

本研究結(jié)果顯示，ATV 組SBI、PLI、TNF-α、IL-17、IL-10、Tb.Sp、CEJ-AC 均低于牙周炎組，IL-10、Tb.Th、Tb.N 均高于牙周炎組，提示ATV 可改善牙周炎大鼠牙周指標，抑制牙槽骨吸收及炎癥反應(yīng)。ATV 是一種抑制HMG-CoA 還原酶的藥物，具有調(diào)節(jié)骨代謝、抑制炎癥和氧化應(yīng)激、促進上皮化及創(chuàng)傷愈合等作用，可通過多種途徑減輕口腔生物膜相關(guān)慢性炎癥性疾病：抑制細胞因子、前列腺素、基質(zhì)金屬蛋白酶等促炎因子釋放，促進IL-10、白介素-4、白介素-13 等抗炎因子產(chǎn)生，控制牙周組織炎癥反應(yīng)；調(diào)節(jié)宿主對細菌刺激反應(yīng)，防止炎癥介導(dǎo)的牙槽骨吸收，促進牙槽骨形成；抑制細菌生長、破壞細菌膜穩(wěn)定性并增加細菌清除率，從而避免感染惡化[13]。

Wnt/β-catenin 信號通路是一種在多種生物過程中發(fā)揮重要作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是細胞生長、分化的重要調(diào)控途徑。當Wnt 信號激活時，Wnt 蛋白與Frizzled 受體和LRP5/6 結(jié)合，從而抑制GSK-3β 對游離β-catenin 促磷酸化作用，促進其轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，與T-cell 因子/淋巴樣增強因子家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶向因子Runx2 表達，從而調(diào)節(jié)骨吸收細胞和骨形成細胞間的平衡[14]。Wnt/β-catenin 信號通路還參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)，影響細胞因子、趨化因子及黏附分子等表達，調(diào)節(jié)炎癥細胞的遷移和活化。本研究結(jié)果顯示，牙周炎組牙周組織Runx2 蛋白表達量、p-β-catenin/β-catenin 低于健康組，GSK-3β 蛋白表達量高于健康組，經(jīng)ATV 干預(yù)后Runx2 蛋白表達量、p-β-catenin/β-catenin 升高，GSK-3β 蛋白表達量降低，提示該通路在牙周炎中被抑制，經(jīng)ATV 干預(yù)后有所改善。此外，在ATV 干預(yù)的基礎(chǔ)上增用Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑可降低ATV 治療效果，提示ATV 可能通過激活該通路發(fā)揮對牙周炎的治療作用。

綜上所述，ATV 可改善牙周炎大鼠牙周指標，抑制牙槽骨吸收，減輕炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)。