葡萄歐亞種與雜交種的營養品質差異研究

陳琪玉，李宇飛,2，徐 航,2，劉賢青,2，羅 杰,2

（1. 海南大學 熱帶作物學院/海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室，海口 570228;2. 海南省三亞崖州灣種子實驗室，三亞 572000）

葡萄（grape ）是葡萄科葡萄屬的藤本類植物，不僅具有悠久的種植歷史，也是目前全球種植面積最大以及產量最高的經濟水果之一[1]。葡萄屬可分為真葡萄和麝香葡萄兩個亞屬共計70多個種，但具有經濟價值的馴化栽培種僅有20多個種且均屬于真葡萄屬，主要包括4大種群：歐亞種、美洲種、東亞種以及三大種群雜交選育出來的雜交種（以下簡稱種間雜交種）[2]。目前中國主要種植的類型為歐亞種與雜交種，其中雜交種的抗病性與環境適應性強于歐亞品種[3]。葡萄作為人們喜愛的水果之一，除了果肉的鮮美以外，以葡萄為原料的副產品如葡萄酒、葡萄汁和葡萄干等也受人們的歡迎[4-5]。在當今社會，消費者對食物的追求除最基本的口感外，對食物中的營養成分及含量水平也提出了更多的要求，因此探究葡萄中所含的營養物質的分布與含量成為研究熱點[6-7]。

氨基酸、維生素、脂質以及類黃酮等物質作為四類常見營養元素，已有研究人員對其在葡萄中的分布情況開展研究。徐雯等[8]對中國河北省內主要種植的6個葡萄品種進行氨基酸的檢測，發現葡萄中主要的氨基酸為谷氨酸、精氨酸、脯氨酸和天冬氨酸等。此外，Tassoni A等[9]通過研究抗病型和感病型葡萄品種的氨基酸水平差異，發現在抗病性強的葡萄品種中，谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸和蘇氨酸等氨基酸的含量均高于感病型的葡萄品種。維生素是生物體維持正常生命活動所必需的營養物質，在生物體的生長發育等代謝過程中發揮重要作用。金洪艷等[10]對葡萄中所含的維生素進行檢測，發現在葡萄中的維生素主要包括維生素B族和C族。脂質主要在葡萄籽中積累，Pérez-Navarro J等[11]對葡萄中所含的脂質進行檢測，發現在果肉中廣泛存在棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和甘油磷脂等脂質，還發現在葡萄籽中不飽和脂肪酸的比例相對較高。類黃酮是葡萄中種類最多且含量最高的營養代謝物，其在葡萄中的分布與含量受到研究人員的廣泛關注，葡萄中主要的類黃酮化合物包括花青素、黃酮醇和黃烷醇等[12]。研究人員還發現類黃酮在葡萄品種間存在很大的積累差異[13]，例如，在大多數紅葡萄品種中，黃烷醇和花青素是類黃酮化合物的主要組成成分，而在白葡萄品種中，酚類物質的含量相對較低，其中黃酮醇和黃烷醇占主導地位[14]。

代謝組學（metabonomics）是通過組群指標分析，進行高通量檢測和數據處理，研究生物體整體或組織細胞系統的動態代謝變化，特別是對內源代謝、遺傳變異、環境變化乃至各種物質進入代謝系統的特征和影響的學科。代謝組與基因組、轉錄組和蛋白組一起構成了系統生物學，代謝物是基因轉錄與蛋白表達的終端產物，承載著生物體眾多的生命活動并體現生物的生命狀態[15]。目前代謝領域常用的研究分析平臺分別是液相色譜質譜聯用系統（LC-MS）、氣相色譜質譜聯用系統（GC-MS）以及核磁共振（NMR）等。因LC-MS具有高靈敏和高重現性的雙重優勢，LC-MS是目前代謝組學研究中應用最廣泛的檢測手段。隨著科學技術的不斷進步與發展，液相色譜體系也從高效液相色譜體系（HPLC）發展到分離比更高的超高效液相色譜體系（UPLC），體系的升級使得物質分離效果和檢測效率得到了大幅度的提升[16]。代謝組學常用物質檢測方法有非靶向代謝檢測[17]、靶向代謝檢測[18]以及廣泛靶向代謝檢測方法[19]，非靶向代謝檢測和靶向代謝檢測的檢測方法各有優劣，而廣泛靶向檢測方法綜合兩者優勢在代謝領域得到了廣泛應用。代謝組學在植物相關研究中至關重要[20]，在植物的品種鑒定、中醫藥學以及園藝作物的品質研究等領域均有廣泛應用[21-23]。

葡萄作為高經濟價值的水果之一，培育味道鮮美和營養價值高且具有廣泛環境適應能力的葡萄品種是研究人員不斷努力的方向。本研究收集了起源于歐亞種群（V.vinifera）或種間雜交種群兩大種群共20份葡萄栽培品種，利用廣泛靶向代謝檢測方法對葡萄群體進行高通量代謝檢測分析，建立了涵蓋多類代謝物質葡萄代謝數據庫，比較了幾類營養代謝物在葡萄歐亞種和種間雜交種之間的分布情況，意為葡萄高營養品種的培育提供新的思路以及理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料 本研究使用的20份葡萄種質資源起源于葡萄歐亞種群（V.vinifera）或雜交種群兩大種群，主要從北京、山西和山東等地的種質資源中心收集。在挑選材料時根據品種來源、果皮顏色以及品種用途等方面進行考量，所有的材料都使用統一的管理方法，包括栽培、灌溉、施肥、修剪和疾病控制等方面。

1.2 代謝樣品提取 先利用真空低溫凍干機將葡萄鮮樣中的水分去除，將凍干后的樣品磨成粉末裝在2 mL離心管中。將凍干粉樣按每份50 mg進行分裝，將分裝后的樣品置于冰上按照W凍干粉樣∶V提取液=1 mg∶8 mL加入由甲醇、乙腈和超純水按V甲醇∶V乙腈∶V超純水=2∶2∶1混合配制而成的提取液，再進行10 s渦旋混勻，然后放入加了冰塊的超聲儀中超聲10 min，渦旋超聲步驟共重復3次。超聲結束后將樣品置于預凍好的4℃高速離心機中離心10 min，吸取上清液打入裝有0.22 μm尼龍濾膜的針筒進行過濾，將濾液裝入含有內插管的棕色代謝瓶中等待上機檢測，整個過程在冰上操作。代謝樣品提取全過程中，除磨樣和樣品分裝2個步驟外，其余操作均需在黑暗條件下進行。

1.3 代謝樣品檢測

1.3.1 液相分離參數 分離使用的液相儀器分別為UltiMate 3 000 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）和DGU-20A5R高效液相色譜儀（島津公司）。檢測用的色譜柱為Shim-pack GISS C18（1.9 μm, 2.1 × 100 mm）反向色譜柱（島津公司），柱溫設為40℃。流動相體系為A相（含0.04 %乙酸水溶液）；B相（含0.04 %乙酸的甲醇溶液）。液相洗脫時間為20 min，梯度為：0～5 min，流動相B相的比例由5 %逐漸增高至95 %，在B相占比達95 %時保持5 min，15.1 min時迅速降至B相比例5 %并保持至洗脫時間結束。在樣品正式檢測前必須使儀器達到平衡狀態，平衡時間大約為3 min。

1.3.2 高分辨質譜檢測參數 使用Q Exactive Plus Orbitrap HRMS儀器進行高分辨數據采集，掃描模式為Full MS/ddMS2，母離子掃描范圍100～1 000 Da,二級譜圖采集范圍50～1 000 Da， 正離子模式下噴霧電壓3.5 kV，毛細管溫度325℃，加熱器溫度350℃，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。

1.3.3 低分辨質譜檢測參數 Q-Trap 6500+MS用于進行代謝物的定量檢測，檢測模式為sMRM。ESI源的參數設置：溫度500℃，噴霧氣（GS1）50，輔助加熱氣（GS2）60，氣簾氣（CUR）35 psi。正離子掃描模式：離子噴霧電壓（IS）5 000 V，去簇電壓（DP）50 V，碰撞電壓（CE）30 V。對代謝信號進行掃描時，分成多個文件，每個文件內放置1 000個離子對進行掃描，掃描窗口設定為70，總的循環時間為0.8 s。數據采集完后由Analyst軟件導出然后導入MultiaQuant 軟件進行后續的定量分析。

1.4 數據統計與分析

1.4.1 代謝數據的定性和定量 非靶檢測所得的原始數據均由Compound Discoverer 3.1軟件進行了峰對齊、反褶積和空白扣除等工作。代謝物定量數據使用 MultiQuant 3.0.3 軟件進行處理。

1.4.2 代謝數據的處理由EXCEL完成 代謝物的聚類熱圖由R語言的pheatmap R包完成；主成分分析（PCA）使用線上網站HIPLOT （https://hiplot.com.cn/）完成。

2 結果與分析

2.1 葡萄代謝物數據庫的建立 利用高分辨儀器UPLC-Q Exactive Plus Orbitrap對葡萄群體的代表性樣本進行非靶向代謝組檢測，并基于以下兩個原則對代謝信號數據進行初步篩選：（1）是否擁有二級碎片；（2）前體離子（Q1）與產物離子（Q3）之差是否小于14，以此將質量較差以及冗余的信號去除。最終，通過非靶檢測共計得到了2 353個代謝信號。為進一步對篩選得到的信號進行定量檢測以及二次篩選，利用Q-Trap 6500+ MS對葡萄群體的代謝信號進行靶向檢測。利用MultiQuant軟件對靶向檢測所得數據進行處理，去除峰型較差以及信噪比在10以下的代謝信號，最終得到了1 328個代謝信號，完成葡萄代謝物數據庫的初步建立。

葡萄代謝物數據庫初步建立后，利用多種方法對葡萄代謝物數據庫中未知代謝信號進行物質注釋。運用高分辨儀器配套的CD（Compound Discover）軟件對采集到的代謝物質進行一個初步匹配，但因軟件的局限性，匹配結果還需結合碎片信息以及出峰時間進行人工核對，再通過由已知到未知的順序，結合實驗室已有代謝數據庫，根據Q1、Q3、碎片信息和保留時間（樣品和檢測儀器的不同會影響RT值，但出峰時間的差異范圍大約在0.5～1 min）等信息注釋了373個代謝物。再利用標準品核驗，將標準品采用樣品同樣的檢測方法進行代謝檢測，根據所得的RT、Q1和Q3的值與已有數據進行匹配，通過該方法注釋了247個物質。

此外，還對部分未知代謝信號進行了人工注釋，如代謝物GRP0421的保留時間是4.97 min（圖1-A），質荷比（m/z）為627.156 2，根據其二級譜圖（圖1-B），發現其主要的碎片為303.049 6，除此之外還有1個小的碎片465.102 6。通過分析該物質的質譜信息，其碎裂模式與糖基化類黃酮類物質的裂解方式非常相似，結合常見黃酮類物質的出峰時間大約在4～8 min，因此筆者推測該物質為類黃酮的糖基化修飾物。對該物質的二級譜圖進行分析，303.049 6為該類黃酮物質母核的特征質荷比，其特征碎片303與另一個主要碎片465以及465與母離子627的中性丟失特征值均為162，恰好符合六碳糖丟失1個水（MW-H2O，162）的質荷比，因此推測在該物質中存在2個六碳糖和1個羥基，再結合CD軟件的匹配結果人為核對后，將該物質注釋為Quercetin 3-glucosylgalactoside，結構式以及物質斷裂模式如圖1-C所示。

圖1 代謝物的鑒定，代謝數據庫物質分類

本研究通過一系列代謝物注釋方法后，在去除冗余值后，建立了1個包含768個已知代謝物的葡萄代謝數據庫，涵蓋了類黃酮、脂質、氨基酸、維生素、有機酸、萜類、多酚及酚胺等九類代謝物（圖1-D），其中類黃酮和脂質化合物的占比較高。

2.2 葡萄代謝譜分析 基于所得代謝物數據庫對葡萄群體進行定量分析后，本研究展開了初步的代謝輪廓分析。根據所得768個已知代謝物對20份葡萄品種利用R語言進行主成分分析（PCA）和聚類熱圖分析（圖2）。由圖2-A可知代謝物可以將葡萄歐亞種和雜交種區分開。為了探究是哪些化合物在葡萄不同種群之間存在差異，對80份栽培葡萄品種進行聚類熱圖分析，由圖2-B可知類黃酮化合物、脂質、萜類化合物以及多酚化合物是造成葡萄品種存在代謝差異的幾類主要化合物，其中萜類化合物在葡萄雜交種中的積累相對高于葡萄歐亞種而類黃酮物質和脂質在葡萄不同種群中的積累存在較大差異。此外，本研究統計了葡萄代謝庫中的768個代謝物的變異系數，發現有482個代謝物的變異系數超過了60%，這說明在本研究中測得的代謝物在葡萄歐亞種和雜交種之間存在較大的積累差異（圖2-C）。

圖2 葡萄群體代謝組分析

2.3 葡萄歐亞種和雜交種差異代謝物分析 為明確在葡萄歐亞種和雜交種之間的代謝物的差異，本研究結合變量權重值（VIP值>1）和差異倍數的計算（Fold Chang<0.8或Fold Chang>1.2）兩種分析代謝物的差異的方法，選取兩種方法的交集，最終共篩選到了185個在葡萄歐亞種和種間雜交種之間的差異代謝物，其中在葡萄種間雜交種中呈現上調的有90種代謝物，有95種代謝物是在葡萄雜交種中出現下調（圖3-A）。

圖3 葡萄不同種群間差異代謝物分析

對185個差異的代謝物的注釋信息進行統計，共有172個代謝物屬于常見代謝物注釋的類別，包含了14種氨基酸及其衍生物、85種類黃酮化合物、40種脂質、4種有機酸、3種酚胺類化合物、3種植物激素、8種萜類化合物以及15種維生素（圖3-B）。這說明了在葡萄不同群體之間代謝物的差異主要由類黃酮、脂質和氨基酸等化合物引起。

2.4 葡萄歐亞種和雜交種營養代謝物的差異利用前述在葡萄中測得到的代謝數據庫，對氨基酸、維生素、脂質和多酚等4類常見營養物質在葡萄的歐亞種和雜交種之間的含量差異進行分析。如圖4-A所示，與歐亞種相比雜交種的總氨基酸的相對含量更高，其中脯氨酸（Proline）和谷氨酰胺（Glutamine）的相對含量分別高于葡萄歐亞種1.5倍和2.6倍，而酪氨酸（Tyrosine）和L-異亮氨酸（L-Isoleucine）在葡萄歐亞種與雜交種的積累含量無顯著差異（圖4-B），說明與歐亞種相比雜交種中氨基酸類化合物的積累相對更多。

圖4 葡萄歐亞種和雜交種間營養代謝物含量差異

本研究發現，在葡萄中維生素B族的代謝物積累存在差異，維生素B3物質在葡萄雜交種中的積累極顯著地高于歐亞種，但維生素B6化合物則在歐亞種中的積累更高（圖4-C）。本研究還發現，維生素C化合物L-抗壞血酸（L-Ascorbic acid）在屬于歐亞種的品種中的相對含量普遍高于屬于雜交種的葡萄品種（圖4-D）。甘油磷酯類化合物在葡萄不同種群中的積累也存在一定的差異，葡萄雜交種中總脂肪酸的相對含量顯著高于歐亞種（圖4-E），但亞麻酸（Linolenic acid）的相對含量在葡萄歐亞種中略高于雜交種（圖4-F）。

類黃酮是葡萄中非常重要的一類營養物質，本研究通過靶向代謝檢測方法共檢測得到225個多酚類化合物，主要包含黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷醇、異黃酮、查爾酮、花青素和芪類化合物等九大類型。對檢測到的多酚類物質進行聚類分析，如圖5所示多酚類化合物在葡萄歐亞種和種間雜交種中存在較大的積累差異，其中黃酮醇類化合物在葡萄歐亞種和種間雜交種的積累模式與總的多酚類化合物在葡萄不同種群中的積累模式相似（圖5-A），說明黃烷醇是形成多酚化合物在葡萄中存在顯著積累差異的主要代謝物。與黃酮醇類物質不同，黃烷醇類化合物在葡萄歐亞種中的總相對含量極顯著高于種間雜交種（圖5-B）。對4種檢測到的花青素在葡萄中的含量進行分析，發現花青素類物質在種間雜交種的品種中相對含量普遍高于葡萄歐亞種的品種（圖5C-F），說明葡萄不同種群之間的雜交可以增加葡萄花青素的積累。

圖5 葡萄歐亞種和雜交種多酚類物質含量差異

3 討 論

本研究以葡萄果實群體為材料，基于代謝組學策略建立了1個包含多類營養物質的葡萄代謝物數據庫。盡管該數據庫包含768個注釋代謝物，但依舊有許多能被檢測到的代謝信號仍未被注釋出來。目前領域內常用的物質注釋方式主要包括利用標準品比對，以及運用數據庫匹配軟件例如CD、MSDIAL和Sirius等通過導入已測得的高分辨數據進行匹配處理[24-25]，這些物質注釋方式方法多少都存在假陽性率過高的局限性。人工解譜也是研究人員會運用到的物質注釋方法之一，但這一方法對相關專業知識要求較高因此使用范圍更加狹窄。本研究主要是運用液相質譜的靶向代謝檢測方式對葡萄群體進行研究，以及主要運用標準品匹配和軟件匹配對代謝物進行注釋，所運用的檢測方法手段還有很大的提升空間，想要構建包含更多注釋代謝物的葡萄代謝物數據庫，還需進一步開發利用更多的方式策略加以完善。

本研究發現，脯氨酸、谷氨酰胺和維生素B3等代謝物在葡萄種間雜交種的相對含量顯著高于葡萄歐亞種，這些代謝物已被報道與植物抗性相關，而種間雜交種群的培育是研究人員為了提高葡萄的抗性以及對于不同環境的適應性而產生的，本研究結果從代謝角度的方面驗證了這一說法。本研究還發現幾種參與葡萄果皮顏色形成的花青素在葡萄種間雜交種的品種中的相對含量高于歐亞品種，已有研究[26]表明運用嫁接砧木的育種方式培育出來的雜交葡萄品種，其果皮中花青素化合物的積累增加，促進了果皮著色，而葡萄顏色是迎合消費者審美的一種非常重要的農藝性狀，這一結果為今后培育色澤鮮艷的葡萄品種提供了理論基礎。通過利用營養成分不同的葡萄種群能為今后提高葡萄產業的價值品質提供代謝方面的物質基礎。

隨著代謝組學的高度發展，以代謝組學為基礎的多組學研究已成為作物育種研究領域常用的手段之一，在藍莓、咖啡和香菜等經濟植物的研究上已被應用[27-29]。本研究建立的葡萄代謝物數據庫為后續基于代謝組結果進一步開展葡萄基于代謝組的多組學分析奠定了代謝研究基礎，有助于有針對性地對葡萄代謝品質等性質進行遺傳機制的解析，為今后葡萄品種選育提供新方向與代謝基礎。