豬TRIM56 全長及其截短體真核表達質粒的構建及蛋白的表達和定位

姚來娣吳香菊齊靜叢曉燕李均同賈杏林杜以軍

(1. 湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙 410128；2. 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室/農業農村部畜禽生物組學重點實驗室，山東濟南 250100)

TRIM56 是三基序蛋白(tripartite motif protein，TRIM)家族中的一員。 根據TRIM 家族成員之間C 末端結構域的結構差異分為11 個亞家族(C-Ⅰ—C-Ⅺ)，而TRIM56 是C-V 亞家族成員之一[1]。 近年來TRIM 家族蛋白的重要性日益凸顯，其不僅廣泛表達于成年哺乳動物的各種組織中，在細胞內信號通路調控和自噬等方面也發揮著重要的調節作用，尤其是在調節先天性免疫應答方面受到高度重視[2-4]。 隨著對TRIM 家族蛋白抗病毒作用的深入研究，發現TRIM 家族蛋白是一種新型的泛素化家族蛋白[5]，而蛋白翻譯后修飾越來越受到重視。 TRIM56 作為泛素化家族成員之一，對其結構及功能也有了初步的了解。

TRIM56 蛋白于2010 年首次被報道[6]，在機體的先天免疫、轉錄調控、細胞凋亡、抑制腫瘤惡性進展等方面都發揮著極其重要的作用，特別是在抗病毒免疫中的功能尤為重要，而這與TRIM56的結構密切相關。 不同種屬的TRIM56 氨基酸組成及結構存在差異，例如豬、人類、小鼠的TRIM56蛋白分別由755、755、734 個氨基酸組成，但它們都具有TRIM 家族共有的3 個N 端保守結構域，即鋅指結構域(RING finger domain)、B-box 結構域和超螺旋結構域(Coil-Coil region)。 其中，鋅指結構域能夠介導不同底物的泛素化，具有E3泛素連接酶特有的標志，因此TRIM56 被認為可以參與蛋白的泛素化蛋白酶體修飾過程[6-7]；Bbox 結構域是TRIM 蛋白所特有的，但其功能目前尚不明確[8]；超螺旋結構域(C-C 區域)通常位于C 端，對于同源相互作用是必要的，其功能主要是促進大分子復合物的形成以及參與同源二聚體的相互作用[9]。 而TRIM56 的C 末端功能還需深入研究。

目前對人TRIM56 的研究較多，而對于豬TRIM56(swine tripartite motif 56，sTRIM56)的研究相對較少。 因此，還需對sTRIM56 結構和功能的更多特點進行深入研究。 本研究構建了sTRIM56 全長及其截短體的真核表達質粒，并檢測其在細胞內的表達及定位，為進一步研究sTRIM56 蛋白全長和其不同結構域的抗病毒作用及分子機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人胚胎腎細胞(HEK-293T)、豬肺泡巨噬細胞(3D4/21)和空載體pXJ41 由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

RNA-easy Isolation Reagent 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL5000DNA Marker、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉錄試劑盒等購自TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA Ligase 購自Thermo Fisher Scientific 公司；質粒小提試劑盒、DNA 回收試劑盒購自北京天根生物工程有限公司；WesternBright Sirius 化學發光檢測試劑盒購自Advansta 公司；Western blotting 一抗稀釋液、DAPI染色液購自碧云天生物技術有限公司；轉染試劑Lipofectamine?3000、Alexa Fluor 488 標記的羊抗鼠IgG 購自Invitrogen 公司；PVDF 膜購自Millipore 公司；青鏈霉素混合液、PMSF、Tween-20、cocktail 購自Sigma 公司；Opti-MEM、高糖型DMEM 細胞培養基、胰蛋白酶購自Gibco 公司；DH5α 感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；兔源Myc 抗體、鼠源Myc 抗體購自Sigma公司；β-actin 抗體購自SantaCruz 公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG 購自武漢博士德公司；4%多聚甲醛通用型組織固定液購自Biosharp 公司；Triton X-100、抗熒光衰減封閉劑購自Solarbio 公司。

1.3 sTRIM56 結構分析及截短體設計

sTRIM56 由755 個氨基酸組成，N 端具有TRIM 家族的3 個保守結構域——鋅指結構域(21～60 aa)、B-box 結構域(164 ～205 aa)和超螺旋結構域(220 ～287 aa)，但其C 末端結構(288 ～755 aa)尚不十分清楚[1，10]。 根據sTRIM56基因序列的結構特點，參考不同種屬的保守序列分析，將其分為4 個不同的截短體，同時為便于表達鑒定，在N 端均添加Myc 標簽，構建真核表達質粒。4 個截短體分段分別為Myc-sTRIM56-ΔRING(80～755 aa)、Myc-sTRIM56-ΔN(210 ～755 aa)、Myc-sTRIM56-ΔC(1 ～287 aa)、Myc-sTRIM56-ΔC-C(1～210 aa)，結構示意圖如圖1 所示。

圖1 sTRIM56 全長及截短體結構示意圖

1.4 sTRIM56 全長及截短體的引物設計

參考NCBI 中sTRIM56的基因序列(GenBank No. KJ881160)，結合真核表達載體pXJ41 的酶切位點，設計含Myc 標簽的擴增sTRIM56基因全長的特異性引物。 同時根據sTRIM56全長序列以及4 個截短體序列的結構特點，分別設計相應的含Myc 標簽序列的擴增sTRIM56截短體的特異性引物。 引物由北京擎科生物技術有限公司合成，引物信息如表1 所示。

表1 PCR 擴增引物及序列

1.5 sTRIM56 全長真核表達質粒的構建及鑒定

豬肺泡巨噬細胞(3D4/21)在24 孔板中培養24 h 后，使用RNA-easy Isolation Reagent 提取總RNA，再使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser RT-PCR 試劑盒進行反轉錄獲得cDNA。 以cDNA 為模板，分別以F-Myc-sTRIM56-EcoRⅠ和R-sTRIM56-BamHⅠ為上、下游引物，PCR 擴增Myc-sTRIM56(WT)全長基因。 PCR 反應體系為25 μL:cDNA 50 ng，dNTP 2 μL，5×PrimeSTAR Buffer 5 μL，F-Myc-sTRIM56-EcoRⅠ和R-sTRIM56-BamH Ⅰ各1 μL，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，ddH2O 補足25 μL。 PCR 反應條件:98 ℃預變性2 min；98 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，35 個循環；72 ℃延伸3 min。 將PCR 產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳并膠回收。

用EcoRⅠ和BamHⅠ分別雙酶切pXJ41 載體和Myc-sTRIM56全長基因，膠回收酶切產物。將目的基因與pXJ41 載體用T4 DNA Ligase 于16 ℃過夜連接；次日，將連接產物轉化到DH5α感受態細胞中，37 ℃過夜培養，挑取單菌落接種于含有氨芐西林(50 μg/mL)的5 mL LB 液體培養基中，37 ℃、200 r/min 過夜培養，次日提取質粒，進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。 鑒定為陽性的質粒送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.6 sTRIM56 截短體真核表達質粒的構建及鑒定

以成功構建的pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)真核表達質粒為模板，Myc-sTRIM56-ΔRING 分別以1F-Myc-sTRIM56-ΔRING-EcoR Ⅰ和RsTRIM56-BamH Ⅰ作為上、 下游引物，Myc -sTRIM56-ΔN 分別以2F-Myc-sTRIM56-ΔNEcoRⅠ和R-sTRIM56-BamHⅠ作為上、下游引物，Myc-sTRIM56-ΔC 分別以F-Myc-sTRIM56-EcoRⅠ和3R-sTRIM56-ΔC-BamHⅠ作為上、下游引物，Myc-sTRIM56-ΔC-C 分別以F-MycsTRIM56-EcoRⅠ和4R-sTRIM56-ΔC-C-BamHⅠ作為上、下游引物，PCR 擴增Myc-sTRIM56各截短體基因。 PCR 反應體系為25 μL:pXJ41-MycsTRIM56 50 ng，dNTP 2 μL，5×PrimeSTAR Buffer 5 μL，上、下游引物各1 μL，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，ddH2O 補足25 μL。 PCR 反應條件:98 ℃預變性2 min；98 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環；72 ℃延伸3 min。 將PCR 產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳并膠回收。

用EcoRⅠ和BamHⅠ分別雙酶切pXJ41 載體和Myc-sTRIM56截短體基因，膠回收酶切產物；將目的基因與pXJ41 載體用T4 DNA Ligase 于16 ℃過夜連接；次日將連接產物轉化到DH5α 感受態細胞中，37 ℃過夜培養，挑取單菌落接種于含有氨芐西林(50 μg/mL)的5 mL LB 液體培養基中，37 ℃、200 r/min 過夜培養，次日提取質粒，進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。 鑒定為陽性的質粒送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.7 Western blotting 檢測融合蛋白的表達

將HEK-293T 細胞鋪于6 孔板中，待細胞密度達到70%～80%時，利用Lipofectamine?3000 轉染試劑分別轉染空載體pXJ41 和鑒定正確的重組質粒pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)、pXJ41-MycsTRIM56-ΔRING、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔN、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC-C 各2 μg，然后置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱培養24 h。 將6 孔板置于冰上，棄上清，用PBS 緩沖液洗2 次后每孔加120 μL 裂解液裂解細胞，20 min 后將樣品收集到1.5 mL EP 管中，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清移至新的1.5 mL EP 管，分別加入40 μL 4×loading buffer 混勻，煮沸15 min，置于-20 ℃保存，用于鑒定蛋白表達情況。

將已處理好的蛋白樣品進行12% SDSPAGE 電泳，電壓分別為濃縮膠80 V、分離膠120 V。 電泳結束后用PVDF 膜進行轉膜，110 V、70 min。 轉膜完畢，用含5%脫脂奶的TBST 室溫封閉2 h，然后TBST 洗膜5 min 并重復5 次。 分別用一抗稀釋液稀釋的兔源Myc 一抗于4 ℃下過夜孵育，TBST 洗膜5 min 并重復5 次。 用含5%脫脂奶的TBST 配制的HRP 標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜5 min 并重復5 次。 用WesternBright Sirius 化學發光檢測試劑盒進行顯色，BIO-RAD 凝膠成像儀進行曝光。

1.8 IFA 檢測融合蛋白的細胞定位

用無菌鑷子夾取細胞爬片置于24 孔板內，接種3D4/21 細胞，當細胞密度達到40%～50%時，利用Lipofectamine?3000 轉染試劑，各孔分別轉染空載體pXJ41 和pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)、pXJ41 -Myc -sTRIM56 -ΔRING、pXJ41 -Myc -sTRIM56-ΔN、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC-C 質粒各0.5 μg，靜置培養24 h 后吸棄培養基，PBS 小心清洗2 次后，用4%多聚甲醛室溫固定30～45 min 或4 ℃過夜。

固定結束后，棄掉4%多聚甲醛，用PBS 清洗10 min 并重復3 次。 加入0.1% Triton X-100 室溫通透30～45 min，用PBS 清洗10 min 并重復3次。 接著室溫孵育鼠源Myc 一抗2 h，用PBS 清洗10 min 并重復3 次。 室溫避光孵育Alexa Fluor 488 標記的羊抗鼠IgG 二抗1 h，PBS 清洗10 min并重復3 次。 加入DAPI，室溫避光作用10 ～15 min，棄掉DAPI，PBS 清洗10 min 并重復3 次。最后加入適量抗熒光衰減封閉劑進行封片，通過Leica 熒光顯微鏡觀察各蛋白在細胞內的定位情況。

2 結果與分析

2.1 sTRIM56 全長真核表達質粒的構建及鑒定

通過RT-PCR 擴增獲得Myc-sTRIM56全長基因。 擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳可見大小約為2 268 bp 的特異性擴增片段，與預期大小相符(圖2)。 重組質粒pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)經EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后得到預期大小的片段(圖3)，序列測定結果表明成功構建了pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)表達質粒。

圖2 Myc-sTRIM56(WT)全長基因的RT-PCR 擴增

圖3 pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)質粒的EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定

2.2 sTRIM56 截短體真核表達質粒的構建及鑒定

通過PCR 擴增獲得Myc-sTRIM56-ΔRING、Myc-sTRIM56 -ΔN、Myc -sTRIM56 -ΔC、Myc -sTRIM56-ΔC-C截短體基因。 擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳可見大小分別為2 028、1 638、861、630 bp 的特異性擴增片段，與預期大小相符(圖4)。 截短體重組質粒經EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后得到預期大小的片段(圖5)，序列測定結果表明成功構建了pXJ41 - Myc - sTRIM56 -ΔRING、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔN、pXJ41-MycsTRIM56-ΔC、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC-C 截短體表達質粒。

圖4 sTRIM56 各截短體基因的PCR 擴增

圖5 sTRIM56 各截短體質粒的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切鑒定

2.3 sTRIM56 全長及截短體蛋白的表達

sTRIM56 全長及截短體的真核表達質粒轉染HEK-293T 細胞后，提取細胞總蛋白，經Western blotting 檢測，結果顯示sTRIM56 全長及截短體重組質粒都能在細胞中表達，分別在約82、73、59、31、23 kDa 處出現特異性的單一蛋白條帶，且條帶大小與Myc-sTRIM56(WT)、Myc-sTRIM56-ΔRING、Myc-sTRIM56-ΔN、Myc-sTRIM56-ΔC、Myc-sTRIM56-ΔC-C 蛋白大小預期相符(圖6)；而空載體僅在約52 kDa 處出現一條非特異性條帶，與其他泳道相同。 表明sTRIM56 全長及截短體蛋白都能在轉染的細胞中正常表達。

圖6 Western blotting 檢測sTRIM56 及其截短體質粒的蛋白表達

2.4 sTRIM56 全長及截短體在細胞中的定位

sTRIM56 全長及截短體的真核表達質粒轉染3D4/21 細胞后，利用IFA 檢測，熒光顯微鏡觀察顯示sTRIM56 全長Myc-sTRIM56-WT 及其不同截短體形式 Myc - sTRIM56 - ΔRING、 Myc -sTRIM56-ΔN、Myc-sTRIM56-ΔC、Myc-sTRIM56-ΔC-C 的蛋白均主要定位于細胞質中(圖7)。

圖7 IFA 檢測融合蛋白的亞細胞定位

3 討論與結論

近年來，研究人員已對TRIM56 蛋白的結構和功能進行了初步的研究和探索，結果表明TRIM56 在機體的許多功能中都發揮著極其重要的作用，特別是其在抗病毒免疫中的作用越來越受到研究者的重視。 最近，TRIM56 被證明是少數能夠正向調節產生干擾素(IFN)的先天性免疫通路的TRIMs 之一[11]。 研究發現TRIM56 在機體先天抗病毒作用中具有多種生物學功能[12]，通過與其他宿主蛋白相互作用參與TLR3 信號通路和IFN-β 信號通路[13-14]。 例如，TRIM56 不僅可以通過與干擾素激活蛋白(STING)相互作用來調節先天免疫應答，促進STING 的K63 連接泛素化，經多聚泛素化修飾靶蛋白，在機體防御病毒入侵方面發揮著重要作用[6]，還可以通過誘導環狀GMP-AMP 合成酶(cGAS)的Lys335 單泛素化，導致其二聚化，從而顯著增加DNA 結合活性以及cGAMP(cyclic GMP-AMP)產生[15]。 除此之外，TRIM56 作為一種多功能蛋白，還可以與病毒蛋白相互作用。

隨著對TRIM56 研究的不斷深入，也有研究指出TRIM56 的抗病毒活性機制不依賴于TLR3/TRIF、RIG-I 或STING，而主要依賴于其E3 泛素連接酶活性和C 端區域的完整性，這表明TRIM56 是一種限制病毒感染的新型抗病毒宿主因子[11，16]，有可能在抗病毒治療方面有著巨大的潛力。 從目前的研究結果來看，TRIM56 主要針對RNA 病毒，如黃熱病毒(YFV)、登革熱病毒血清型2(DENV2)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)以及人類冠狀病毒OC43(HcoV-OC43)等[16-18]，其RING＋超螺旋＋C 末端部分序列影響YFV 的復制，RING＋C 末端部分序列影響DENV2 的復制，RING 結構域＋完整C 末端影響BVDV 的復制，RING 結構域影響HCoV-OC43 的復制等[11]，可見TRIM56 可以通過不同結構域來抑制病毒的復制。 此外，TRIM56 對DNA 病毒如單純皰疹病毒1 型(HSV-1)也有一定防御作用[15，19]。 盡管一些研究指出TRIM56 在肺中表達最為豐富，但關于TRIM56 對呼吸道病毒如流感病毒等負鏈RNA病毒的抗病毒譜及特性知之甚少[16]。

近年來雖然TRIM56 的研究主要集中于人，但對豬TRIM56 的研究也不可忽視。 目前，sTRIM56 的B-box 結構域、C-C 區域或C 末端區域的其他部分等是否在sTRIM56 的抗病毒免疫反應中發揮重要作用仍不清楚，其具體機制和功能研究尚不徹底，許多抗病毒作用也有待闡明；同時，研究已表明人TRIM56 主要定位在細胞漿中[20]，但豬TRIM56 是否也定位于細胞漿中尚未明確，且sTRIM56 的具體功能與定位之間的關系還很模糊不清，需要進一步研究和探索。

本研究首先構建了sTRIM56 全長及其4 個截短體的真核表達質粒，經雙酶切及測序進行了鑒定，進一步轉染HEK - 293T 細胞確定了sTRIM56 全長及其截短體蛋白的表達，并在3D/421 細胞中探索了其表達的蛋白主要定位于細胞質中。 這些研究結果可為探究sTRIM56 蛋白及其不同結構域在真核細胞中的功能以及在抗病毒先天免疫反應中的作用奠定基礎。