貝萊斯芽孢桿菌CL-4 固態發酵對豆粕營養品質的影響

瞿子惠，劉歆，鄭琳，魏炳棟，閆曉剛，于維，陳龍，郎洪彥

(吉林省農業科學院動物營養與飼料研究所，吉林公主嶺136100)

豆粕是食品和飼料領域常見的優質植物性蛋白來源。 豆粕中主要的抗原蛋白是大豆球蛋白和β-伴球蛋白，分別占豆粕總蛋白的30%和40%左右[1]。 當幼齡仔豬攝入這類蛋白質時，會引起過敏，導致吸收不良綜合征、生長抑制和腹瀉。 此外，豆粕中還含有非淀粉多糖，主要由纖維素、半纖維素和果膠組成，被證實是導致斷奶仔豬腸道疾病的誘因[2]。 發酵豆粕通過添加有益微生物，如少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，可以有效去除部分對動物有害的抗營養因子，從而改善豆粕營養品質，提高動物消化利用率[3-5]。

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)作為芽孢桿菌中新劃分的一個種，于2016 年與B. methylotrophicus、B. amyloliquefacienssubsp. plantarum、B. oryzicola重新歸類并命名為B. velezensis[6]。 有關B. velezensis的研究集中于生物防治和促進植物生長等方面[7-8]。 貝萊斯芽孢桿菌于2020 年被列入歐盟安全資格認定(QPS)推薦的生物制劑列表中，可作為新型發酵飼料菌種[9]，有關B.velezensis在畜禽應用的報道逐漸增多[10]，主要集中在飼料霉菌毒素[玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)和黃曲霉毒素B1(AFB1)]脫毒[11]和水產益生菌方面[12]。 本研究團隊主要開展有關B.velezensis在木質纖維素利用方面的研究，前期成功分離并鑒定一株來自雞盲腸內容物的B.velezensisCL-4，具有富產木質纖維素酶優勢，同時具有抑制病原細菌和真菌的能力，對動物安全無毒，具有良好的益生特性[13]。 現已完成了該菌株的全基因組測序，并成功用于發酵玉米胚芽粕，獲得授權發明專利《一株禽源貝萊斯芽孢桿菌CL-4及其應用》(專利號:202110109964.X)。 豆粕常用發酵菌多為枯草芽孢桿菌[2]、釀酒酵母菌[14]、植物乳桿菌[15]等，僅有少數文獻報道了貝萊斯芽孢桿菌發酵豆粕的應用[16]。 因此，本研究利用B. velezensisCL-4 發酵豆粕，探究發酵前后豆粕中抗營養因子、營養成分、微生物、酶活力以及表觀形態等變化，旨在為生物蛋白飼料提供新型優良菌種，為進一步改善發酵豆粕營養品質提供理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和發酵原料 菌種貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)CL-4 分離自肉雞盲腸內容物，病原指示菌為金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922，均由吉林省農業科學院動物營養與飼料研究所保存，豆粕購自吉林省公主嶺禾豐牧業有限責任公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNS 試劑、LB 培養基、大豆球蛋白和β-伴球蛋白ELISA 試劑盒購自北京龍科方舟生物工程技術有限公司，植物蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物有限公司。 控搖床，恒溫培養箱，高壓滅菌鍋，超凈工作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 豆粕抗原蛋白平板制備及菌株降解能力測定 抗原蛋白培養基的制備:稱取5 g 豆粕，磨碎后過60 目篩，加入pH 8.5 的Tris-HCl 緩沖液75 mL，30 ～50 ℃、 200 r/min 振蕩1 h，9 000 r/min離心40 min，沉淀再浸提一次，合并兩次上清液。 向上清液中加入NaHSO3至0.01 mol/L，用2 mol/L HCl 調pH 至6.4，4 ℃沉淀過夜。 于6 500 r/min、4 ℃離心30 min，得到大豆球蛋白沉淀。 上清液加NaCl 至0.25 mol/L，調pH 至4.0 ～6.0，室溫攪拌30 min，9 000 r/min、4 ℃離心30 min，上清液稀釋2 倍，調pH 至4.8，6 500 r/min離心20 min 得到β-伴球蛋白沉淀。 將所有沉淀溶于ddH2O，調pH 至5.5 ～6.5，加入1.5%(w/v)瓊脂，115 ℃滅菌20 min。

抗原蛋白平板制備:在滅菌培養皿中加入15 mL 抗原蛋白培養基，待冷卻后再加入營養培養基(蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂20 g/L，121℃高壓滅菌15 min)15 mL，冷卻至凝固，待培養基表面無明顯水跡后，將已滅菌的牛津杯置于試驗平板中，輕輕加壓，使其與培養皿接觸無空隙，4℃保存備用。

菌株降解豆粕抗原蛋白能力測定:根據Wongputtisin 等[17]的方法制備候選菌株B. velezensis CL-4 粗上清液，過0.22 μm 微孔濾膜。 取100 μL 粗上清液加入抗原蛋白篩選平板的牛津杯中培養24 h，以添加100 μL 生理鹽水為對照。 若菌株對抗原蛋白有降解作用，即可見到水解圈。 根據水解圈直徑與牛津杯孔徑比值測定B. velezensisCL-4 的豆粕抗原蛋白降解能力。

1.2.2 發酵豆粕的制備 將B. velezensisCL-4 在37 ℃液體LB 培養基中培養12 h 以備固態發酵。將豆粕121 ℃高壓滅菌處理20 min，稱取滅菌后的豆粕100 g 于500 mL 燒瓶中，發酵菌種添加量為107CFU/g，最終含水量為40%，攪拌均勻后用濾菌呼吸膜封住瓶口于37 ℃下發酵24 h，然后105 ℃、30 min 阻斷發酵。 以0.85%無菌生理鹽水為對照，重復3 次。 將發酵樣品65 ℃烘干24 h，冷卻研磨過60 目篩，用于SDS-PAGE 和營養成分分析。

1.2.3 pH 值和發酵代謝產物相關指標測定 準確稱取0、24 h 的發酵樣品各1.00 g 溶于9.0 mL蒸餾水中，室溫150 r/min 振蕩10 min，靜置1 min后測定pH 值；采用倍比稀釋法測定發酵樣品中活菌數；通過DNS 法測定纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶活力，中性蛋白酶活力測定參考行業標準SB/T 10317—1999；使用瓊脂擴散法測定發酵后豆粕的抑菌性，以金黃色葡萄球菌ATCC25923 和大腸埃希菌ATCC25922 作為抑菌試驗的指示劑。

1.2.4 營養成分分析 根據AOAC(2005)測定發酵前后豆粕中干物質、粗纖維、粗蛋白、纖維素、半纖維素、總磷、鈣和灰分等含量。 根據Ovissipour等[18]的方法測定發酵前后豆粕中酸溶蛋白含量。采用氨基酸自動分析儀測定發酵前后豆粕中氨基酸含量。

1.2.5 豆粕抗原蛋白定量檢測 利用間接競爭性ELISA 法測定發酵前后豆粕中大豆球蛋白和β-伴球蛋白含量，采用北京龍科方舟試劑盒進行。

1.2.6 SDS-PAGE 分析 根據植物蛋白提取試劑盒說明書提取發酵0、12、24 h 豆粕可溶性蛋白，使用Bio-Rad 蛋白定量試劑盒將上清液定量至50 μg/mL，分別配制12%分離膠和5%濃縮膠，采用穩流35 mA 電泳至蛋白進入分離膠，然后設定穩流45 mA 電泳至溴酚藍離膠底1 cm，最后采用考馬斯亮藍染色和脫色液脫色，直至凝膠背景脫凈。

1.2.7 掃描電鏡觀察 取發酵前后豆粕樣品0.1 g 包裹于濾紙內，用2.5%戊二醛4 ℃浸泡過夜。掃描電鏡觀察倍數分別為1 000、1 500、3 000。

1.3 數據統計與分析

使用SPSS 軟件(24.0)通過Student’st-test和單因素方差分析(ANOVA)對數據進行統計分析，各組間數據顯著差異水平設定為P＜0.05，數值表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 B. velezensis CL-4 降解豆粕抗原蛋白能力測定

如圖1 所示，B. velezensisCL-4 胞外上清液在大豆抗原蛋白篩選板上顯示出較大直徑水解圈，而生理鹽水對照沒有出現水解圈，初步推斷B.velezensisCL-4 胞外上清液具有降解大豆抗原蛋白的能力。

圖1 B. velezensis CL-4 降解豆粕抗原蛋白能力

2.2 豆粕發酵前后營養成分比較分析

如表1 所示，與發酵前相比，B. velezensisCL-4 固態發酵24 h 后，豆粕干物質含量由93.25%±0.36%下降至92.69%±0.32%，粗蛋白含量由46.78%±0.32%增加到51.28%±0.24%，酸溶蛋白含量由5.15% ±0.04%顯著提升至10.74% ±0.12%，鈣、灰分和總磷含量均有所提高。 粗纖維含量顯著降低，其中半纖維素含量從19.92%±0.11%下降到13.23%±0.09%，纖維素含量由7.41%±0.05%降低到5.85%±0.08%。 各種氨基酸含量均呈上升趨勢，除精氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、酪氨酸和脯氨酸外，其他必需和非必需氨基酸顯著提升(P＜0.05)。 與原始豆粕相比，固態發酵飼料的總氨基酸含量由41.72%±0.40%顯著提高至48.14%±0.14%。 因此，B. velezensisCL-4 固態發酵可顯著提高豆粕營養品質，降低粗纖維含量。

表1 B. velezensis CL-4 發酵前后豆粕營養成分分析%

2.3 發酵豆粕抗菌活性

圖2顯示，與未發酵豆粕的上清液相比，固態發酵24 h 后的豆粕上清液在MH 固體培養基上對金黃色葡萄球菌ATCC25923 和大腸埃希菌ATCC25922 具有明顯的抑菌圈。 因此，B. velezensisCL-4 固態發酵豆粕具有一定的抗菌活性。

2.4 發酵豆粕pH 值、活菌數及酶活力變化

由表2 可知，與發酵前相比，B. velezensisCL-4 固態發酵豆粕的活菌數從(8.13±0.04) log CFU/g顯著增加到(10.28±0.29) log CFU/g；pH值從6.64±0.02 小幅增加到7.01±0.05；纖維素酶活力由(7.57±0.41) U/g 提升至(18.73±1.67)U/g，木聚糖酶活力由(7.21±0.48) U/g 提升至(23.92±1.48) U/g，果膠酶活力由(5.52±0.38)U/g 上升至(14.05± 2.71) U/g，β-甘露聚糖酶活力由(6.52±0.12) U/g 提升至(17.64±0.84) U/g，中性蛋白酶活力由(7.90±0.74) U/g 提升至(235.93±10.19) U/g，各種酶活力均顯著提高。

表2 B. velezensis CL-4 發酵豆粕pH 值、活菌數及酶活力變化

2.5 發酵豆粕抗原蛋白降解效果

SDS-PAGE 分析結果(圖3)顯示，在24 h 發酵過程中，豆粕分子量大于35 kDa 的蛋白亞基逐步降解，而15～24 kDa 的蛋白含量逐漸提高。 大豆抗原蛋白亞基中的β-伴球蛋白亞基(α 和α′)分子量在70～100 kDa 左右，發酵12 h 基本降解，而β-伴球蛋白β′亞基分子量為60 kDa 左右，于24 h 被降解。 因此，B. velezensisCL-4 固態發酵可將豆粕中大分子抗原蛋白降解成小分子肽類。

圖3 B. velezensis CL-4 發酵豆粕可溶性蛋白分子量變化

ELISA 定量檢測結果(表3)顯示，與發酵前相比，B. velezensisCL-4 固態發酵24 h 后，豆粕中大豆球蛋白含量由(176.14±3.15) mg/g 降低至(26.58±1.22) mg/g，降解率可達84.91%；β-伴球蛋白含量由(134.66±2.24) mg/g 下降至(25.65±0.75) mg/g，降解率可達80. 95%。 表明B.velezensisCL-4 固態發酵可顯著降低豆粕中大豆球蛋白和β-伴球蛋白含量。

表3 B. velezensis CL-4 發酵豆粕抗原蛋白的降解效果

2.6 發酵過程中豆粕表觀形態變化

掃描電鏡觀察結果(圖4)顯示，發酵前豆粕結構緊湊、表面光滑。B. velezensisCL-4 固態發酵24 h 后，豆粕的塊狀結構被大量分解，呈現出碎片、破裂和多纖維素結構，表明B. velezensisCL-4固態發酵可明顯改變豆粕表觀形態，有效降解木質纖維素。

3 討論與結論

豆粕來源廣泛且營養豐富，是動物飼料中主要的植物源性蛋白資源。 然而，豆粕中含有多種抗營養因子，限制了其在幼齡動物日糧中的廣泛應用[17]。 研究表明微生物發酵可以部分降解豆粕中抗營養因子，從而改善其營養品質[19-20]。

本研究中，抗原蛋白平板法測定驗證了新型菌種B. velezensisCL-4 可降解豆粕抗原蛋白，B.velezensisCL-4 固態發酵24 h 后，豆粕中大豆球蛋白和β-伴球蛋白的降解率可分別達84.91%和80.95%。 由于原料在發酵前已經滅菌且發酵過程也是無菌的，不涉及外源或天然微生物影響，因而B. velezensisCL-4 在豆粕發酵過程中發揮主要作用。 SDS-PAGE 測定的豆粕可溶性蛋白分子量變化與酶聯免疫吸附法測定的大豆球蛋白和β-伴球蛋白在發酵過程中的降解趨勢一致。 此前研究也在B. velezensisCL-4 全基因組序列中檢測到絲氨酸蛋白酶、氨基肽酶、金屬蛋白酶等多種蛋白水解酶的基因[13]。 在酶活力檢測中也發現，B.velezensisCL-4 中性蛋白酶活性顯著提高，有效分解豆粕中抗原蛋白。 Wang 等[4]采用兩段發酵法通過枯草芽孢桿菌CW4 和糞腸球菌CWEF 發酵豆粕和玉米混合底物，營養價值顯著提高。 Yao等[21]發現枯草芽孢桿菌N-11 厭氧發酵豆粕可增加酸溶蛋白(ASP)含量，最高達到13.48%，大豆球蛋白和β-伴球蛋白分別降低82.38%和88.32%。Shi 等[2]發現在玉米-豆粕混合飼料中接種枯草芽孢桿菌B. subtilis 和屎腸桿菌E. faecium，大豆球蛋白和β-伴球蛋白的降解率分別為86.12%和77.53%。 以上研究與本試驗結果一致，在后續研究中還需要通過2DE 電泳和蛋白質組學對發酵產物中的蛋白質作進一步研究。

本研究中，B. velezensis CL-4 固態發酵豆粕與原始豆粕相比含有更高含量的粗蛋白和氨基酸含量，與前人的報道一致[3，22]。 發酵過程中干物質的損失也可能導致粗蛋白和氨基酸的增加[23]。B. velezensis CL-4 可顯著提高豆粕中酸溶蛋白含量主要是由于在發酵過程中，豆粕抗原蛋白或其他蛋白水解形成小分子肽和游離氨基酸[24]。 本研究中，B. velezensis CL-4 發酵豆粕對金黃色葡萄球菌ATCC25923 和大腸埃希菌ATCC25922 具有一定抑制能力，可部分替代飼料中的抗生素。

本研究中，與原始豆粕相比，發酵豆粕中纖維素和半纖維素降解率分別為21.05%和33.58%。在豆粕發酵過程中幾種非淀粉多糖降解酶(纖維素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶和果膠酶)的活力均顯著上升。 掃描電鏡觀察發現與原始豆粕相比，發酵豆粕表面結構呈現開裂和多孔結構，說明其中木質纖維素組分可能被部分降解，而這與非淀粉多糖降解酶密切相關。 此外，隨著纖維素和半纖維素的降解，豆粕中蛋白組分更容易被B.velezensis CL-4 分泌的蛋白酶所分解，因此發酵豆粕可能會具有更高的養分消化率。

目前生物發酵飼料常用的發酵菌種為芽孢桿菌、乳酸菌以及酵母菌。 中國生物飼料產業創新戰略聯盟最新發布并實施的《發酵飼料技術通則》中明確指出發酵飼料菌種只允許添加飼料添加劑品種目錄(2013 年)規定的相應菌種，可用菌種約為35 種，而歐盟食品安全局(EFSA)可利用的菌種數量可達80 余種[25]。 因而，新型發酵菌種的研發和應用急需開展。 貝萊斯芽孢桿菌菌株通常從土壤、植物根際、河流、動物腸道和發酵食品等來源分離獲得[26]，其相關研究集中于生物防治和促進植物生長等方面[27-28]。 貝萊斯芽孢桿菌已于2020 年被列入歐盟安全資格認定(QPS)推薦的生物制劑列表中，可作為新型發酵飼料菌種[29]。 全基因組學分析發現B. velezensis CL-4有大量編碼木質纖維素降解酶的基因，其發酵產生的碳水化合物酯酶、果膠酸裂解酶和碳水化合物結合模塊(CBMs)也可能影響纖維素和半纖維素降解[13]。 此外，在GH1-13[30]、FZB42[8]、ZY-1-1[31]、LS69[32]和UCMB5113[33]等B. velezensis 基因組中均發現參與降解纖維素和半纖維素的酶基因。 但有關將B. velezensis 應用于動物飼料益生菌和生物發酵飼料中的報道仍然較少。

本研究通過高產蛋白酶和木質纖維素降解酶的B. velezensis CL-4 發酵豆粕，可降解豆粕中抗營養因子(大豆抗原蛋白、纖維素和半纖維素)，顯著改變了原始豆粕的營養特性，提高了營養品質和功能代謝物(活菌數、酶活力以及抑菌活性)，可作為新型發酵豆粕菌種，具有廣闊的應用前景。