基于網絡藥理學分析益氣活血化痰方抗動脈粥樣硬化的作用機制

孫琳潔,陳 昕,俞佳利,李屹龍,薛金貴

心血管疾病是當前嚴重危害人類健康的疾病之一。動脈粥樣硬化(AS)主要累及大、中動脈,導致脂質沉積、內膜纖維化,同時粥樣斑塊引起管壁變硬、管腔狹窄,導致心血管不良事件的發生,其發生發展是多個危險因素共同作用的結果,目前認為其主要與炎癥反應、血脂代謝異常及內皮細胞損傷等因素有關[1-2]。益氣活血化痰方由黃芪、丹參、全瓜蔞、水蛭、黃連組成,具有抑制炎癥反應、調節血脂代謝、穩定粥樣斑塊等功效,從而降低心血管不良事件的發生風險[3-8]。本研究利用網絡藥理學的方法,對益氣活血化痰方進行分析,探討其抗AS的可能機制。

1 資料與方法

1.1 收集益氣活血化痰方活性成分及相關靶點

基于中藥系統藥理學數據庫分析平臺(https://www.tcmsp.e.com/,TCMSP)篩選益氣活血化痰方的有效成分,其中黃芪、丹參、全瓜蔞、黃連以口服生物利用度(OB)>30%、類藥性(DL)>0.18為條件篩選有效成分。同時,收集文獻資料整理水蛭的化學成分,并通過檢索有機小分子生物活性數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/,PubChem)獲得各成分的化學結構,其中未被PubChem平臺收錄的成分則利用ChemDraw軟件繪制其化學結構,最終將所有化學結構的sdf格式文件上傳至瑞士毒藥物動力學數據庫(http://www.swissadme.ch/,SwissADME)獲取活性成分。篩選條件:胃腸道吸收力(GI absorption)為High,類藥效(Druglikeness)的Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 5種規則中至少符合2項。在PubChem數據庫中,物種選擇“homo sapiens”,獲取益氣活血化痰方中有效成分的簡化分子線性輸入規范(SMILES),并導入瑞士靶點預測數據庫(http://swisstargetsprediction.ch/,Swiss targets Prediction),以“probability>0”為條件獲取所有潛在靶點。

1.2 獲取AS靶點與篩選共同靶點

在基因名片數據庫(https://www.genecards.org/,GeneCard)中獲取AS基因,根據相關度(relevance score)進行由大到小的排序,以第三四分位數為條件進行篩選獲得基因靶點,通過韋恩Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖,獲得益氣活血化痰方與AS的共同靶點。

1.3 構建藥物-疾病靶點蛋白質互作(PPI)網絡圖

將益氣活血化痰方與AS的共同靶點導入功能性蛋白關聯網絡數據庫(http://string-db.org,STRING) ,在“homo sapiens”背景下獲取tsv文件,導入Cytoscape 3.9.1,使用Analyze Network工具進行拓撲分析,以拓撲學參數度值(Degree)≥第三四分位數為條件篩選獲得關鍵靶點。

1.4 富集分析

在David數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)中對關鍵靶點進行基因本體(GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析,選擇物種為homo sapiens,以P<0.01為條件將富集基因數由大到小排序,獲得排名前20位的生物通路。利用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)將數據進行可視化分析,繪制柱形圖和氣泡圖。

1.5 構建“活性成分-核心靶點-信號通路”網絡

篩選出KEGG富集分析中富集基因數排名前20位的通路,找出富集在這些通路上的潛在靶點,并匯總與靶點相對應的藥物活性成分。以活性成分、靶點、通路為節點,導入Cytoscape 3.9.1軟件,構建益氣活血化痰方治療AS的成分-靶點-通路網絡圖。

2 結 果

2.1 益氣活血化痰方活性成分及相關靶點

共獲得益氣活血化痰方的有效成分為:丹參65個,瓜蔞11個,黃連14個,黃芪20個,并根據相關文獻報道收集水蛭化學成分68個[9-16],建立了水蛭化學成分數據庫,最終獲得有效成分36個(見表1)。將有效成分導入Swiss targets Prediction數據庫并獲得相關靶點,刪除重復值后獲得益氣活血化痰方的有效靶點1 004個。

表1 水蛭活性成分基本信息

2.2 AS靶點與益氣活血化痰方藥物共同靶點

從GeneCard數據庫提取AS靶點1 191個,利用Venny 2.1平臺獲取疾病與益氣活血化痰方靶點交集,獲得265個共同靶點。詳見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點韋恩圖

2.3 藥物-疾病靶點PPI網絡圖

在STRING數據庫上傳共同靶點,采用Cytoscape 3.9.1軟件對結果進行可視化,獲得PPI網絡,PPI網絡共有263個節點、4 428條邊。詳見圖2。節點大小和顏色深淺代表Degree值的大小,節點越大、顏色越深則Degree值越大,表明聯系越緊密。以“Degree值≥第三四分位數”為條件篩選,獲得關鍵靶點36個。詳見圖3。

圖2 益氣活血化痰方治療AS的共同靶點PPI網絡圖

圖3 益氣活血化痰方治療AS的關鍵靶點PPI網絡圖

2.4 GO與KEGG富集分析

使用David數據庫對關鍵靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析,利用微生信平臺將富集數據可視化。GO富集分析由生物過程(biological process,BP)、細胞組分(celluar component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3部分組成。以基因數量(Count)值為縱坐標、富集條目為橫坐標匯制GO富集三合一柱狀圖(見圖4),可見在益氣活血化痰方抗AS機制中,BP主要包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、基因表達的正向調控、轉錄的正調控和DNA模板、凋亡過程的正向調控等;CC主要包括核、質膜、細胞質、胞漿等;MF主要包括蛋白質結合、相同的蛋白質結合、酶結合、轉錄因子結合等。

圖4 關鍵靶點GO富集分析

KEGG通路分析獲得122條通路,選取基因富集數較小的20條通路,繪制氣泡圖(見圖5),橫坐標代表基因所占百分比,縱坐標代表基因通路,氣泡尺寸代表基因數,氣泡顏色代表富集倍數,氣泡越大則表示通路作用越顯著。可見,益氣活血化痰方抗AS的主要通路包括癌癥的通路、脂質和AS、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終產物及其受體(AGE-RAGE)信號通路在糖尿病并發癥中的應用、卡波西肉瘤相關性皰疹病毒感染、蛋白質聚糖在癌癥中的應用等。

圖5 關鍵靶點的KEGG通路富集氣泡圖

2.5 “活性成分-關鍵靶點-信號通路”網絡

選取相關活性成分93個、關鍵靶點36個和前20條潛在通路,將數據導入Cytoscape 3.9.1繪制成分-靶點-通路相互作用的網絡圖(見圖6)。網絡圖包含146個節點、645條邊線。

3 討 論

AS屬中醫“脈痹”“血痹”范疇,其病機為本虛標實,瘀血、痰濁、氣滯為標,臟腑虛損為本。益氣活血化痰方由黃芪、丹參、全瓜蔞、水蛭、黃連組成,方中黃芪益氣養心,其性溫,味微甘,能補氣,兼能升氣,善治胸中大氣;丹參活血化瘀、養心通絡;水蛭破血逐瘀,其味咸、色黑、氣腐、性平,為其味咸,故善入血分,為其原為噬血之物,故善破血,為其氣腐,其氣味與瘀血相感召,不與新血相感召,故破瘀血而不傷新血;黃連能夠清熱燥濕、瀉火解毒,防止久瘀化熱;全瓜蔞滌痰散結、寬胸開郁。另外,氣虛容易導致血瘀,血瘀容易導致氣滯,氣行推動血行,則瘀血得治。

益氣活血化痰方可影響各種炎癥信號通路發揮抗炎作用,對靶蛋白具有調節作用,同時能夠調節脂質代謝、穩定粥樣斑塊、改善血管內皮功能、抗氧化[17-18]。黃芪還可提高胰島素敏感性,保護心腦血管,抑制心臟重構,保護心肌,促進心肌梗死后的血管重建,改善能量代謝,抑制細胞凋亡[19-21]。丹參的藥理作用還包括抗腫瘤[22]、抑制心肌肥大[23]等。全瓜蔞具有擴張冠狀動脈、抗血小板凝集、保護心肌的作用[24]。水蛭在抗血小板凝集、抗凝方面也有顯著的作用[15]。

本研究運用網絡藥理學,獲得益氣活血化痰方與AS的共同靶點,構建PPI網絡,篩選出關鍵靶點,其中,蛋白激酶 B1(AKT1)、禽肉瘤病毒17假定轉化基因(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、p38絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、核因子Kappa Bp65(RELA)、腫瘤壞死因子(TNF)等在益氣活血化痰方抗AS過程中尤為重要。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)可將信號從細胞表面傳導至細胞核內部[25]。MAPK3/1即細胞外信號調節激酶(ERK1/2),與腫瘤的發生密切相關[26-27];ERK通路的激活與炎癥反應也密切相關[23]。MAPK14在細胞轉錄調節、細胞骨架識別及細胞凋亡中發揮重要作用,該關鍵靶點的激活能夠促進炎性細胞因子的產生[28-29]。研究表明,MAPK通路抑制劑特異性地抑制多種炎性因子的產生,從而顯著阻斷炎癥反應的發生[23,28-29]。TNF具有造血、抗感染、免疫監視和抗腫瘤等作用,可通過與腫瘤壞死因子受體1型(TNFR1)結合,激活核因子 Kappa B(NF-κB)、MAPK以及c-Jun通路,促進白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等促炎性細胞因子的表達,介導炎癥反應[30-32]。另外,在NF-κB炎癥通路介導的免疫應答過程中,RELA基因調控也發揮重要的作用[33]。同時,TNF與腫瘤壞死因子受體2型(TNFR2)結合,激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT) 通路,AKT1又是PI3K/AKT通路的重要組成,AKT1參與調節內皮型一氧化氮合酶(eNOS)及一氧化氮(NO)生成,增加AS斑塊的不穩定性,其水平的升高與AS的發生發展密切相關[34-35]。PI3K/AKT通路及下游信號分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)可以影響AS中巨噬細胞脂質代謝、極化分型、自噬等過程,影響AS的疾病進程[36-37]。研究發現,Janus激酶2/信號轉導與轉錄激活子3(JAK2/STAT3)信號通路能夠通過介導炎性因子促進動脈內膜增厚,增加抗炎性因子,以促進動脈斑塊的消退[38-39]。STAT3信號轉導促進血管平滑肌細胞增殖遷移,誘導新生內皮及血管的形成,促進AS的進展,因此,抑制IL-6/STAT3通路能夠降低心血管疾病的風險[40-41]。CXCL8參與炎癥反應的發生[42],MMPs中的基質金屬蛋白酶-9(MMP9)能夠促進細胞外基質降解以及血管平滑肌細胞的遷移[43-44]。CXCL8可以顯著提高基質金屬蛋白酶(MMPs)的活性,同時MMPs通過蛋白水解效應增加CXCL8的生物學活性,CXCL8與基質金屬蛋白酶(MMPs)兩者相互影響,共同導致AS不斷進展和惡化[45-46]。非受體酪氨酸激酶(SRC)是由多種細胞外信號分子激活的蛋白激酶,SRC在各種細胞因子誘導下,通過激活ERK1/2、p38/MAPK、PI3K/AKT等信號轉導通路,誘導細胞增殖,導致內皮功能紊亂,促進血管內皮細胞的增殖和遷移[47-49]。同時,促進脂多糖(LPS)介導的巨噬細胞的遷移以及炎癥反應,誘導巨噬細胞合成和分泌炎性因子,導致AS進展[50]。

上述相關研究涉及此次網絡藥理學所預測的關鍵靶點,表明益氣活血化痰方對AS具有一定的療效,該過程中,炎性因子的表達以及炎癥反應的發生、血管內皮細胞的增殖和遷移發揮了關鍵作用;其次,通過KEGG富集分析結果可知,藥物-疾病之間的潛在通路中,與AS密切相關的主要是脂質和AS通路。

本研究通過網絡藥理學,對益氣活血化痰方治療AS的作用機制進行了初步分析,發現其具有多成分、多靶點和多通路的特點,為AS的治療提供了研究思路和理論基礎。然而,網絡藥理學對于中藥作用研究的復雜性具有局限性,還需要通過更多深入的研究來驗證這些理論,提供更加有力的科學依據。