基于網絡藥理學和分子對接分析小續命湯治療阿爾茨海默病的作用機制

鄒旭歡,付雪琴,王瑋瑋,王漫漫,蘭 瑞

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種以感覺或運動功能喪失、記憶力減退和癡呆癥為主要表現的神經系統退行性改變,多發于中老年人,占全部癡呆類型的60%～80%[1]。我國2015—2018年AD患病率為6.6%,根據國家人口預測,2050年AD患病人數約為3 003萬人,其病理學特征為淀粉樣蛋白(amyloid-beta peptide,Aβ)沉淀形成的老年斑和tau蛋白的過度磷酸化形成的神經細胞內神經原纖維纏結,組織病理學研究顯示,AD神經元細胞骨架不規則、突觸異常[2-4]。AD病情的發生、發展與線粒體突觸功能失常、Aβ的形成和積累、Tau蛋白的過度磷酸化、miRNA的失調、突觸損傷、氧化應激、炎癥反應、乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)的缺失等密切相關[5]。目前,尚無特效藥物可治愈或逆轉AD的疾病過程,僅能減輕癥狀、延緩病情發展。小續命湯首見于孫思邈的《千金要方》,由12味藥組成,歷代醫家常用來治療中風病,現有的臨床及動物實驗表明,小續命湯可保護腦卒中后的神經血管單元、神經元細胞、線粒體等,除此之外,也在降血脂、抗凝血、改善學習記憶能力方面具有重要作用[6]。基于中醫辨證施治的“異病同治”理論,研究發現,提取出的小續命湯有效成分組對β-淀粉樣蛋白片段、L-谷氨酸、過氧化氫的損傷具有保護作用,且采用高效液相色譜法能夠快速有效地分析小續命湯抗AD成分中的有效成分,為小續命湯治療AD提供了可行的理論支撐[7-8]。小續命湯藥物味數多、成分復雜,目前關于小續命湯治療AD的具體作用機制尚未明確。因此,本研究采用網絡藥理學方法預測小續命湯有效成分治療AD的潛在靶點和作用機制,并通過分子對接技術進行驗證。

1 資料與方法

1.1 小續命湯有效成分與靶點預測

在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php,TCMSP)中查詢藥物的有效活性成分,并以通用的口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選標準進行初篩,核查去重后,獲得小續命湯總的有效活性化合物。在UniProt數據庫中進行靶點基因名轉換,去重后獲得小續命湯的靶點基因。

1.2 AD疾病相關靶點的獲取

以“阿爾茨海默病(Alzheimer disease)”為檢索詞分別挖掘在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)、基因名片(GeneCard)數據庫獲得AD的潛在治療靶點,合并數據庫靶點,去重后獲得總的AD靶點。

1.3 小續命湯治療AD潛在靶點蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及拓撲分析

利用韋恩圖制作軟件Venny 2.1.0制作藥物靶點與AD疾病交集圖,將交集靶點輸入STRING數據庫構建PPI網絡,設定物種“homo sapiens”,獲得PPI網絡并下載TSV文件。再將獲得的TSV文件導入Cytoscape 3.7.2中,通過“Network Analyzer”工具進行拓撲分析,通過度值(Degree)排序,篩選核心靶點。利用Cytoscape 3.7.2繪制小續命湯藥物-成分-作用靶點-疾病網絡圖。

1.4 關鍵成分通路富集分析

將交集靶點導入Metascape數據庫進行基因本體(gene ontology,GO)分析與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,并繪制圖形展示。

1.5 利用AutoDock Vina進行關鍵活性成分和靶點的分子對接

將篩選出的Degree值排名前5位的關鍵蛋白與其相應的關鍵活性成分進行能量匹配、空間匹配,展示靶點與成分之間的親和力。

2 結 果

2.1 小續命湯有效成分獲取與篩選

以OB≥30%和DL≥0.18為準則在TCMSP中篩選藥物有效成分,最終獲得小續命湯(麻黃、桂枝、防風、防己、杏仁、黃芩、人參、川芎、白芍、附子、甘草、生姜)有效成分共182種(見表1)。將獲得的蛋白質靶點在UniProt數據庫進行基因名匹對,剔除重復項后獲得靶點基因272個。

表1 小續命湯的有效活性成分

2.2 AD疾病相關靶點的獲取

檢索OMIM疾病數據庫,分別獲得AD靶點835個,從Genecard數據庫獲得AD靶點9 606個,依照“相關性得分”(relevance score)進行中位數篩選,經過3次中位數篩選,最后以中位數11.428 988 46為界限,獲得相關性較大的靶點1 201個,合并2個數據庫靶點并去除重復值后獲得1 834個靶點。

2.3 小續命湯與AD交集靶點韋恩圖及PPI網絡構建

分別將272個藥物靶點與1 834個疾病靶點輸入Venny 2.1.0軟件,獲得交集靶點139個(見圖1),并導入String數據庫,設定物種“homo sapiens”,構建小續命湯藥物與AD蛋白相互關系網絡圖(見圖2)。

圖1 小續命湯治療AD交集靶點韋恩圖

圖2 小續命湯治療AD交集靶點PPI網絡圖

2.4 基于PPI網絡的拓撲分析

將獲得的TSV文件導入Cytoscape 3.7.2,利用Net work Analyer插件計算得出靶點的相關度評分,根據Degree值獲得小續命湯治療AD關鍵靶點,與AD相關的排名前5位的靶點為信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、P53腫瘤蛋白(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、V-REL網狀內皮增生病毒癌基因同源物A重組蛋白(RELA)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT1)。詳見表2。利用Cytoscape 3.7.2繪制小續命湯藥物-成分-作用靶點-疾病網絡圖(見圖3),并計算Degree值,篩選出排名前5位的活性成分,分別是槲皮素、山柰酚、木樨草素、漢黃芩素、β-谷甾醇(見表3)。

圖3 小續命湯藥物-成分-作用靶點-疾病網絡圖(紅色圓形為疾病名稱,粉色菱形為靶點基因,綠色正方形為藥物成分,橘黃色橢圓形為藥物活性成分)

表2 小續命湯治療AD排名前20位的靶點

表3 小續命湯治療AD的關鍵活性成分

2.5 小續命湯治療AD的潛在靶點GO富集分析

GO富集分析獲得AD相關的5 231條生物過程(BP),結果顯示,小續命湯治療AD在生物過程中,主要參與對無機物的反應(response to inorganic substance)、對激素的反應(response to hormone)等。在細胞組分(CC)富集到486項,說明治療過程中主要通過膜筏(membrane raft)、囊腔(vesicle lumen)、質膜外側(external side of plasma membrane)、受體復合體(receptor complex)、內質網內腔(endoplasmic reticulum lumen)等部位進行。分子功能(MF)富集到712項,其中信號受體調節活性(signaling receptor regulator activity)、激酶結合(kinase binding)、蛋白質同源二聚化活性(protein homodimerization activity)等最為緊密。選取結合度排名前10位的結果進行可視化,繪制柱狀圖,柱狀圖橫軸代表生物學過程,縱軸代表靶點的數量。詳見圖4。

圖4 GO分析柱狀圖

2.6 小續命湯治療AD潛在靶點KEGG通路富集分析

在KEGG通路富集結果中,共富集到259條通路,結果顯示,脂質與動脈粥樣硬化通路(lipid and atherosclerosis)、晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體信號通路(advanced glycosylation end products-receptor of AGEs,AGE-RAGE)、神經退行性病變相關通路(pathways of neurodegeneration-multiple diseases)、缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路(HIF-1 signaling pathway)等與小續命湯治療AD密切相關。關系緊密的前10條通路通過氣泡圖進行展示。詳見圖5。

圖5 KEGG富集氣泡圖

2.7 利用AutoDock Vina進行關鍵活性成分和靶點的分子對接

分別通過PubChem和PDB數據庫獲取關鍵成分的3D結構及核心蛋白質結構,運用Autodock Vina軟件進行分子對接,Pymol軟件可視化顯示,且分子對接結果顯示STAT3、AKT1與槲皮素結合更緊密。詳見圖6、表4。

圖6 有效成分槲皮素、山柰酚、漢黃芩素與STAT3、AKT1結合位點圖

表4 關鍵分子與靶點對接親密度

3 討 論

AD屬中醫“癡呆”范疇,病屬本虛標實,以腎虛為本,痰濁、瘀血為標[9]。小續命湯出自《千金要方》,為治療中風的常用方劑,治療中風病標本兼顧,收效頗豐。小續命湯中用附子引人參走于十二經,溫陽復陽以固腎,引川芎入血分,行血養血以滋養真陰。元陽、真陰藏于腎,癡呆起病以腎虛,小續命湯溫陽滋陰固腎,故而治于癡呆。

在對活性成分的篩選中,篩選出槲皮素、山柰酚、木樨草素、漢黃芩素、β-谷甾醇等排名靠前。槲皮素存在于麻黃、甘草中,可穿透血腦屏障而發揮神經保護作用[10]。研究表明,槲皮素可抑制Aβ聚集和Tau磷酸化,抑制乙酰膽堿酯酶活性、抗氧化應激,并減輕炎癥反應,在3xTg-AD轉基因AD小鼠模型,腹腔注射槲皮素進行治療,可減少AD小鼠海馬和杏仁核中的Tau蛋白過度磷酸化、Aβ的堆集,從而改善認知功能[11]。乙酰膽堿的缺失會導致AD癥狀加重,乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)可降解ACh,抑制AChE活性可改善AD的認知障礙[1]。槲皮素是AChE和丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase,BChE)的競爭性抑制劑,可抑制AChE繼發于疏水性相互作用和與酶的強氫鍵結合,從而減少ACh的水解[12]。線粒體是活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生的主要部位,線粒體功能障礙可導致ROS過度積累,從而產生氧化應激,隨后ATP耗竭導致細胞死亡[13-14]。槲皮素作為有效的抗氧化劑,通過誘導核因子E2相關因子2/抗氧化反應元件通路(Nrf2/ARE)和對氧磷酶2(paraoxonase 2,PON2)激活調節AD中錯誤折疊的蛋白質聚集體的形成和降解[13,15]。槲皮素通過抑制小膠質細胞中一氧化氮、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達,以減輕炎癥,延緩AD的進展[16]。山柰酚存在于中藥麻黃、白芍、甘草、人參中,研究發現,AD模型果蠅暴露于山柰酚環境中可降低氧化應激和AChE活性,延緩攀爬能力、記憶力的喪失[2]。Aβ-42的沉積會增加AChE的表達,乙酰膽堿酯酶活性升高、乙酰膽堿轉移酶活性的降低,使AD病人腦內的ACh的表達明顯減少,而山柰酚可以降低Aβ-42的毒性,并與其寡聚體結合,形成無毒寡聚體,進而阻斷Aβ斑塊的構象轉變,以改變Aβ誘導的神經元壞死、氧化應激、炎癥反應、小膠質細胞活化等一系列加重AD病情的病理過程[17-18]。漢黃芩素存在于防風、黃芩中,研究發現,其可通過抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路自噬介導促進原代神經星形膠質細胞中Aβ的清除,從而抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)以減少Tau蛋白的磷酸化,通過下調促分裂素原活化蛋白激酶/核轉錄因子(MAPK/NF-κB)信號通路以緩解Aβ25-35刺激的PC12細胞中的神經元凋亡和炎癥發揮神經保護作用,以達到治療AD的目的[19-20]。木樨草素存在于麻黃中,β-谷甾醇存在于小續命湯多味中藥中,研究發現,木樨草素和β-谷甾醇均具有較強的抗氧化、抗炎作用[21-22]。對于PPI網絡關鍵靶點質譜分析中,STAT3、AKT1、TNF、血管內皮生長因子A(VEGFA)等靶點對小續命湯治療AD起到關鍵作用。在AD病理環境的刺激下,小膠質細胞激活,促進神經斑塊附近的星形膠質細胞活化為A1型,高表達凋亡相關基因,損傷神經突觸,推進AD病程的進展[23]。在對AD的實驗研究中發現,可通過調控Janus激酶2(JAK2)/STAT3信號通路抑制星形膠質細胞活化,并負反饋調節抑制蛋白3(SCO3)的表達,抑制促炎的釋放,減輕神經炎性反應,修復神經元結構和功能[24-25];并可調控STAT3參與的miR-124/STAT3軸以抑制Aβ誘導的海馬神經元凋亡,從而治療AD[26]。AKT1可在不同的通路中發揮抗AD的作用,研究表明,在其參與的PI3K/AKT通路的活性減少會增加Tau蛋白磷酸化以及Aβ斑塊沉積增加,AKT基因過度表達可降低Tau蛋白過度磷酸化[27-28];而抑制AKT1-mTOR信號通路表達可以誘導自噬以延緩AD模型衰老和Aβ的表達水平[29]。ROS介導的AKT1的氧化修飾可導致AD中的突觸功能障礙,在突觸中促進AKT1-mTOR信號傳導的治療策略可能為AD的疾病緩解治療提供新的靶標[30]。TNF-α是小膠質細胞在被持續激活狀態下釋放的,可加重AD的神經元變性和腦組織損傷[31-32]。在使用遺傳和藥理學的研究表明,TNF-α信號傳導在體內會加劇Aβ和Tau病理[33]。且研究發現,TNF-α可抑制膽堿能神經元突觸傳遞,加重中樞膽堿能系統損害[3]。VEGFA是一種高度特異性地促血管內皮細胞生長因子,可促進血管內皮細胞遷移和血管新生,血管內皮細胞損傷會增強血腦屏障的通透性,使外周Aβ更易進入大腦,腦內Aβ含量堆集,外周的有害物質更易進入大腦,激活小膠質細胞釋放促炎因子,誘發神經元凋亡,從而誘發癡呆[34]。

AD病人分為輕、中、重3度,輕度病人主要以近期記憶力喪失、視空間障礙為主;中度病人學習新知識、工作能力減退,出現明顯的人格改變;重度病人已不能完成基本日常活動,終日無語而臥床,與外界逐漸喪失接觸能力,因此,營養水平與AD的發展及預后呈正相關[4]。腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)可提高學習與記憶能力,研究表明,AD病人的BDNF表達下降,血清BDNF、尿酸(UA)水平與病人認知功能損傷呈負相關[35-36]。在本課題組的前期研究中發現,在腦缺血再灌注損傷動物模型中,小續命湯可上調缺血半暗帶皮層BDNF、膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)的表達,減輕急性腦缺血再灌注導致的神經細胞損傷,改善神經功能缺損癥狀[37]。這為小續命湯治療AD提供了理論支撐。

KEGG信號通路富集結果顯示,小續命湯治療AD可能與脂質與動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號通路等有關。動脈粥樣硬化不僅是缺血性腦卒中的危險因素,也是認知障礙的相關因素,而且年齡、動脈高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病和肥胖是AD和動脈粥樣硬化的共同危險因素,針對危險因素治療AD、動脈粥樣硬化也是臨床治療的共通點[38]。在臨床研究中發現,通過對比患有和未患有腦血管動脈粥樣硬化的AD病人2年內的神經認知功能和日常生活活動的過程發現,患有腦血管動脈粥樣硬化的AD病人,在神經心理學評估下的認知能力呈現進行性損害且不受動脈粥樣硬化患病時間和顱外或顱內位置的影響,動脈粥樣硬化通過減少腦血流量引起大腦缺氧從而促進腦內Aβ的積累,加重AD,而Aβ的積累又可通過影響內皮功能、氧化應激和炎癥反應促進動脈粥樣硬化的發生[39-41]。在動物實驗中發現,通過CCAAT-增強子結合蛋白(C/EBPβ)/天冬氨酸內肽酶(AEP)信號通路傳導可將動脈粥樣硬化與AD的發病機制結合起來,AEP是由酸中毒激活的半胱氨酸蛋白酶,主要存在于內切溶酶體中,其作為δ-分泌酶分別在N585和N368殘基處切割I類跨膜蛋白(APP)和Tau,加速Aβ的產生和Tau聚集[42]。用小分子抑制劑抑制AEP可阻斷AD病變,改善AD小鼠模型中的認知功能障礙,頸動脈粥樣硬化病人的頸動脈斑塊和血漿中的AEP均增加[43-45]。而C/EBPβ在衰老過程中調節AEP的基因(LGMN)mRNA轉錄,從3xTg小鼠中敲除C/EBPβ可降低AEP水平并消除AD病變,恢復認知功能[46]。高脂血癥載脂蛋白E敲除(ApoE-/-)小鼠中C/EBPβ的造血缺失可減輕炎癥和高脂血癥,從而中斷動脈粥樣硬化的病理發展[47]。2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)與AD之間的臨床關系存在爭議,雖然兩者之間并沒有明確的相關性,但有研究表明T2DM是AD的獨立危險因素,兩者都與衰老和晚期局部淀粉樣蛋白沉積有關,胰島素異常、胰島素抵抗和晚期糖基化終產物(AGEs)對神經淀粉樣蛋白斑塊和神經原纖維纏結的發展都有影響[5]。胰島素可調節AD發病過程中淀粉樣蛋白、神經原纖維纏結的主要成分Aβ和Tau的代謝,通過競爭胰島素降解酶參與Aβ降解的金屬蛋白酶,促進Aβ沉積[6]。而AGE及其受體RAGE對ROS反應敏感,從而增加相互作用,促進Aβ的合成,導致Aβ沉積和Tau蛋白磷酸化,最終形成了斑塊和神經原纖維纏結[7]。且高遷移率族框1(HMGB1)和與RAGE相互作用以產生其他ROS的S100的合成,從而增強AD病理學進展[48]。

綜上所述,小續命湯通過多成分、多靶點、多通路治療AD,靶向作用STAT3、AKT1、TNF、VEGFA等關鍵靶點,涉及抗氧化應激與體內營養水平進行治療,涉及激酶結合、蛋白質同源二聚化活性、蛋白質結構域特異性結合、氧化還原酶活性等分子功能,作用于膜筏、囊腔、突觸后膜、受體復合體等細胞部位。本研究利用網絡藥理學收集了小續命湯治療AD的潛在靶點,可能為進一步研究小續命湯治療AD的實驗及臨床應用提供理論依據,但由于數據庫不全,導致可能數據收集不完備,潛在靶點及可能機制無法進行全面的挖掘及分析,此外,小續命湯治療AD的研究較少,尚未形成完整的理論及實驗驗證體系,尚需進一步研究明確小續命湯治療AD的潛在機制,為AD的治療提供科學的理論指導、理論指導實驗、實驗驗證理論,對小續命湯治療AD的作用機制進行更深一步的研究。