人參皂苷Rg2對阿霉素誘導的心臟毒性模型小鼠心肌的保護作用機制研究

孟培培,王 蓓,劉 光,董魁星,麻繼臣

阿霉素(DOX)是一種DNA拓撲異構酶Ⅱ抑制劑,是一種被廣泛使用的抗腫瘤藥物,通常用于治療血液腫瘤、神經母細胞瘤和乳腺癌等[1-2]。然而,其劑量依賴性的心臟毒性作用往往會導致心功能異常,影響其臨床應用,可表現為心肌病、心律失常、心功能不全甚至心力衰竭等一系列病理變化[3-4]。阿霉素誘導的心臟毒性涉及氧化應激、纖維化、自噬和細胞凋亡失調[5]。人參具有舒張血管、抗腫瘤、抗糖尿病、抗應激及抗氧化作用[6]。人參皂苷Rg2是原人參三醇的主要成分之一,具有提高心肌氧利用率、增強超氧化物歧化酶(SOD)活性、清除自由基等作用,可改善心肌缺血損傷[7-8]。此外,人參皂苷Rg2還通過抑制炎性因子的表達、減少壞死性下垂,保護心肌細胞免受缺氧/復氧誘導的損傷[8]。研究顯示,人參皂苷Rg2可抑制心臟毒性模型大鼠的心肌細胞凋亡,但其保護性機制尚未明確[9]。本研究探討人參皂苷Rg2對阿霉素誘導的心臟毒性模型小鼠心肌的保護作用和潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡C57BL/6雄性小鼠60只,體質量20～25 g,購自廣州銳格生物科技有限公司,許可證號:SYXK(粵)2021-0259。將小鼠分組飼養在通風籠中,溫度(25±1)℃,相對濕度(55±10)%,晝夜循環12 h,小鼠食物和水按標準喂養。

1.2 主要試劑

人參皂苷Rg2和右美托咪定購自美國Sigma公司;末端脫氧核苷酸轉移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標記(TUNEL)試劑盒購自北京碧云天公司;比色分析試劑盒購自美國Sigma公司;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物公司;丙二醛(MDA)、SOD、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)購自南京建成生物公司;抗體購自美國Abcam公司。Masson三色染色試劑盒(貨號:G1340)購自北京索萊寶科技有限公司。蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號:C0105S)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 動物模型構建及分組[9-12]

適應性飼養2周后,將小鼠隨機分為對照組、模型組、右美托咪定組、Rg2-L組、Rg2-M組、Rg2-H組和Rg2-H+LY294002組,其中Rg2-H組和Rg2-H+LY294002組每組5只,其余各組每組10只。除對照組僅給予無菌生理鹽水腹腔注射外,模型組、右美托咪定組、Rg2-L組、Rg2-M組、Rg2-H組、Rg2-H+LY294002組小鼠通過腹腔注射20 mg/kg 阿霉素建立心臟毒性模型。在模型建立前30 min,右美托咪定組給予右美托咪定50 μg/kg腹腔注射,Rg2-L組、Rg2-M組和Rg2-H組分別給予5、10、20 mg/kg人參皂苷Rg2腹腔注射,Rg2-H+LY294002組給予10 mg/kg LY294002、20 mg/kg人參皂苷Rg2腹腔注射,之后每日注射1次,連續干預5 d,5 d后處死小鼠,收集左心組織進行后續實驗。

1.4 超聲心動圖

各組小鼠給予5%異氟烷麻醉,在超聲心動圖采集期間,小鼠保持全身麻醉,持續給予2%異氟烷。使用配備MS400換能器(Visual Sonics)的VisualSonics Vevo 2100系統進行經胸超聲心動圖檢查。收縮功能指標由長軸M型掃描獲得。收集的參數包括左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室射血分數(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。

1.5 組織學分析

將小鼠心臟于10%甲醛中固定24 h,然后包埋在石蠟中。將包埋的石蠟標本切成5 μm的切片,采用蘇木精-伊紅(HE)染色[13]和Masson染色[14],并用數碼顯微鏡拍攝照片。取每個部分的5個不同視野進行數據分析。

1.6 人參皂苷Rg2對血清心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、肌紅蛋白(MB)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平的影響

按ELISA試劑盒說明書檢測cTnI、H-FABP和MB水平。使用比色分析試劑盒檢測血清CK-MB水平。

1.7 氧化應激標志物MDA、SOD、CAT和GSH-Px活性測定

切除小鼠心室組織并用冰冷的緩沖液在勻漿器中制備勻漿液。勻漿液在室溫下以1 780×g離心15 min。按照制造商說明,使用診斷試劑盒測定上清液中SOD、CAT、GSH-PX和MDA的活性。

1.8 TUNEL檢測心肌凋亡情況[15]

使用原位凋亡檢測試劑盒(日本Takara公司)進行TUNEL染色檢測心肌凋亡。石蠟包埋的心臟組織切片在二甲苯中脫蠟,用梯度乙醇的水溶液再水化,并在室溫下用蛋白酶K消化15 min。然后將載玻片在含有TUNEL反應混合物(37 ℃)中的加濕室中培養1 h,并于DAPI中培養10 min。

1.9 蛋白免疫印跡(Western Blot)法

用放射免疫沉淀法緩沖液在4 ℃下提取心肌組織總蛋白,使用二喹啉甲酸法(BCA)試劑盒(北京碧云天公司)測定蛋白質濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)對目標蛋白進行電泳,然后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5 %脫脂牛奶封閉1 h后,用稀釋的一抗Caspase-3(1∶1 000)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)(1∶1 000)、蛋白激酶B(AKT)(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。用與辣根過氧化物酶結合的二抗結合一抗,并用增強化學發光法(ECL)顯示。β-actin用作內參對照。結果由Image J分析的灰度值表示。

1.10 統計學處理

2 結 果

2.1 人參皂苷Rg2對小鼠LVESD、LVESD、LVEF和LVFS的影響

與對照組比較,模型組LVESD升高,LVEF和LVFS降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,右美托咪定組、Rg2-M組和Rg2-H組LVESD降低,LVEF和LVFS升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠LVEDD、LVESD、LVEF和LVFS比較(±s)

2.2 人參皂苷Rg2對小鼠心肌組織病理損傷的影響

與對照組比較,模型組小鼠心肌細胞空泡數量增加,成纖維細胞明顯升高,伴有炎性細胞浸潤和心肌細胞肌漿溶解;與模型組比較,右美托咪定組、Rg2-M組和Rg2-H組纖維排列整齊,細胞排列更加規則,成纖維細胞明顯減少,炎性細胞浸潤較少。詳見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠心肌組織病理損傷改變(HE染色,×100)

圖2 各組小鼠心肌組織病理損傷改變(Masson染色,×100)

2.3 人參皂苷Rg2對小鼠血清cTnI、H-FABP、MB和CK-MB表達水平的影響

與對照組比較,模型組小鼠血清中cTnI、MB、H-FABP和CK-MB水平明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,右美托咪定組、Rg2-M組和Rg2-H組cTnI、H-FABP、MB和CK-MB水平明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 各組小鼠血清cTnI、H-FABP、MB和CK-MB水平比較(A為各組cTnI水平比較;B為各組H-FABP水平比較;C為各組MB水平比較;D為各組CK-MB水平比較。模型組與對照組比較,＊ P<0.05;與模型組比較,# P<0.05)

2.4 人參皂苷Rg2對氧化應激標志物表達水平的影響

與對照組比較,模型組MDA含量明顯增加,SOD、CAT和GSH-Px的活性明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,右美托咪定組、Rg2-M組和Rg2-H組MDA表達降低,SOD、CAT和GSH-Px的活性升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖4。

圖4 各組MDA、SOD、CAT和GSH-Px比較(A為各組MDA含量比較;B為各組SOD活性比較;C為各組CAT活性比較;D為各組GSH-Px活性比較。模型組與對照組比較,＊ P<0.05;與模型組比較,# P<0.05)

2.5 人參皂苷Rg2對小鼠心肌凋亡細胞、Caspase-3表達的影響

與對照組比較,模型組小鼠心肌凋亡細胞率明顯升高,Caspase-3表達上調,差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,右美托咪定組、Rg2-M組和Rg2-H組心肌凋亡細胞率降低,Caspase-3蛋白表達下調,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖5～圖7。

圖5 各組小鼠心肌組織細胞凋亡染色圖(TUNEL染色,×100)

圖6 各組小鼠心臟組織Caspase-3蛋白表達條帶圖

圖7 各組小鼠心肌細胞凋亡率和Caspase-3蛋白表達比較(A為各組細胞凋亡率比較;B為各組Caspase-3相對蛋白表達量比較。模型組與對照組比較,＊ P<0.05;與模型組比較,# P<0.05)

2.6 人參皂苷Rg2對PI3K/AKT通路的影響

與對照組比較,模型組PI3K和AKT蛋白相對表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,右美托咪定組、Rg2-M組和Rg2-H組PI3K和AKT蛋白相對表達水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖8、圖9。

圖8 各組小鼠心臟組織PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達條帶圖

圖9 各組小鼠心臟組織PI3K和AKT磷酸化水平比較(A為各組p-AKT/AKT比較;B為各組p-PI3K/PI3K比較。模型組與對照組比較,＊ P<0.05;與模型組比較,# P<0.05)

2.7 人參皂苷Rg2通過調控PI3K/AKT通路對心臟毒性模型小鼠心肌損傷的影響

與Rg2-H組比較,LY294002抑制了人參皂苷Rg2的抗纖維化、抗氧化應激和抗凋亡作用(P<0.05)。詳見圖10～圖13。

圖10 各組小鼠心臟組織PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達條帶圖

圖11 各組小鼠心肌組織病理損傷改變(Masson染色,×100)

圖12 各組小鼠心肌組織細胞凋亡染色圖(TUNEL染色,×100)

圖13 各組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值、cTnI、CK-MB、GSH-Px和細胞凋亡率比較(A為各組p-PI3K/PI3K比較;B為各組p-AKT/AKT比較;C為各組cTnI水平比較;D為各組CK-MB水平比較;E為各組MDA水平比較;F為各組GSH-Px比較;G為各組細胞凋亡率比較。模型組與對照組比較,＊ P<0.05;與模型組比較,# P<0.05;與Rg2-H組比較,△ P<0.05)

3 討 論

阿霉素是應用較廣泛的化療抗癌藥物之一,長期使用可導致心血管毒性等嚴重影響,胸痛、心悸、心電圖異常、LVEF降低和心肌酶譜改變等是阿霉素誘導的心臟毒性的臨床癥狀[2,16]。目前,阿霉素促進心臟損傷的機制仍存在爭議,本研究采用阿霉素誘導的急性心臟毒性小鼠模型作為研究對象,探討人參皂苷Rg2對阿霉素模型小鼠心肌的保護作用,結果顯示,阿霉素模型小鼠出現心功能下降,心肌細胞空泡數量增加,成纖維細胞明顯增多,伴有炎性細胞浸潤和心肌細胞肌漿溶解等病理改變,人參皂苷Rg2處理可明顯干預這些病理變化,提示人參皂苷Rg2在心臟毒性中具有保護作用。

氧化應激是原發性和繼發性心肌損傷的主要因素,在阿霉素誘導的心臟毒性模型中,SOD活性降低,ROS積累增加,心臟毒性加重[17]。MDA是一種劇毒的脂質過氧化物質,可以遷移到細胞內外,從而加劇氧化應激引起的損傷范圍[18]。本研究中,人參皂苷Rg2減少了MDA含量,同時也增加了抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px的活性,提示人參皂苷Rg2可降低阿霉素誘導的心臟氧化應激,從而改善心功能。氧化應激還可通過激活心磷脂氧化和增加線粒體通透性加速細胞死亡,從而觸發Caspase信號并促進心肌細胞凋亡[19]。本研究中,人參皂苷Rg2處理明顯減少了小鼠心肌凋亡細胞數量和Caspase-3蛋白表達,提示人參皂苷Rg2可抑制阿霉素誘導的小鼠心肌細胞凋亡。

PI3K/AKT通路是細胞生長和存活的主要調節因子,可為心肌細胞提供必要的細胞生存信號,激活PI3K/AKT從而改善阿霉素誘導的心肌損傷[20-22]。在本研究中,人參皂苷Rg2處理可明顯上調PI3K和AKT蛋白相對表達量,提示人參皂苷Rg2可激活PI3K/AKT信號通路,而PI3K抑制劑LY294002處理顯著逆轉了人參皂苷Rg2的抗氧化應激和抗凋亡作用,進一步提示人參皂苷Rg2通過激活PI3K/AKT通路來保護阿霉素誘導的心臟毒性模型小鼠的受損心肌。

綜上所述,本研究闡明了人參皂苷Rg2對阿霉素誘導的心臟毒性模型小鼠的受損心肌的保護作用,其機制與通過激活PI3K/AKT信號通路、抵抗氧化應激損傷、抑制心肌細胞凋亡有關。