基于Klotho/FGF23軸探討益氣活血通絡(luò)方對高磷誘導(dǎo)血管平滑肌細胞鈣化的影響

李旭峰,冷冬月

慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)病人患心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)的風(fēng)險越來越大[1-2]。盡管在慢性腎病的發(fā)展過程中,各種導(dǎo)致心血管并發(fā)癥的危險因素已被廣泛認識,但仍無法解釋心血管疾病的具體分子機制。血管鈣化(vascular calcification,VC)是慢性腎病的主要并發(fā)癥之一,主要發(fā)生在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中,在心血管疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是心血管疾病的重要危險因素[3]。血管鈣化的形成與VSMCs的成骨分化和凋亡、不穩(wěn)定和負載鈣和磷酸鹽的細胞外小泡的釋放等病理機制有關(guān)[4]。在慢性腎病的病因中,磷酸鈣鹽的異常沉積與血管鈣化密切相關(guān)[5]。研究表明,血清無機磷酸鹽升高是慢性腎病人群中血管鈣化和心血管發(fā)病率和死亡率的危險因素[6-7]。因此,研究高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化的具體分子機制具有重要意義。

益氣活血通絡(luò)方由黃芪、丹參、當歸、赤芍、紅花、桃仁、川芎、地龍組成,具有補益腎氣、活血通絡(luò)的功效。臨床研究發(fā)現(xiàn),益氣活血通絡(luò)方對慢性腎臟疾病的腎功能具有較好的保護作用,可用于慢性腎衰竭、糖尿病腎病的治療,可控制血糖水平,有效降低尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮水平,提高腎小球濾過率,改善腎功能[8-10]。而益氣活血通絡(luò)方對慢性腎病病人的血管鈣化是否具有改善作用還未可知。因此,本研究通過高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化,初步探究益氣活血通絡(luò)方對血管鈣化的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

無特定病原體(SPF)級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠18只,體質(zhì)量(200±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證為SCXK(京)2019-0009。大鼠在12 h明暗交替、溫度(20±2)℃、相對濕度45%～60%的環(huán)境中飼養(yǎng)。所有動物實驗均獲得動物保護和使用機構(gòu)委員會(IACUC)的批準。

1.2 藥品及試劑

1.2.1 藥品

益氣活血通絡(luò)方,組方:黃芪30 g,丹參20 g,當歸15 g,赤芍10 g,紅花10 g,桃仁10 g,川芎20 g,地龍10 g。以上藥材均為中藥配方顆粒,購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司,使用時將所有配方顆粒混勻后加入蒸餾水配制成混懸液。按照人與大鼠體表面積換算的方法計算大鼠給藥劑量。人體重以70 kg計,換算大鼠的等效劑量為人的6.3倍。益氣活血通絡(luò)方成人每日給藥劑量相當于生藥1.79 g/kg,則大鼠每日給藥劑量為11.28 g/kg。

1.2.2 試劑

β-甘油磷酸(β-GP,美國Sigma-Aldrich公司,貨號:G9422);胎牛血清、胰蛋白酶、改良Eagle(DMEM)培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司;sh-Klotho及其陰性對照質(zhì)粒(sh-NC)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;成纖維細胞生長因子23(FGF-23)基因過表達腺病毒(Ad-FGF23)和重組腺病毒空載體(AdLaz)購自漢恒生物科技(上海)有限公司;聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)引物序列由上海GenePharma公司設(shè)計合成。堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(P0321S)、細胞計數(shù)法(CCK-8)試劑盒(C0038)購自碧云天生物科技公司;茜素紅染色試劑(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G8550);TRIzol RNA分離試劑及SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均購自日本TaKaRa公司;鈣離子含量測定試劑盒(比色法)購自美國Sigma-Aldrich公司,貨號:MAK022;兔抗Klotho(ab203576)、FGF23(ab98000)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(ab108531)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)(ab192256)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2)(ab214821)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?488)(ab150077)、山羊抗兔IgG H&L辣根過氧化物酶(HRP)(ab205718)均購自英國Abcam公司。

1.2.3 儀器

細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司;ABI Prism?7300型熒光定量PCR系統(tǒng)(美國);倒置熒光顯微鏡(IX73)購自日本Olympus公司;iMark680多功能酶標儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 VSMCs的分離、培養(yǎng)與鑒定

提取和培養(yǎng)原代大鼠胸主動脈VSMCs[3]。取6只大鼠,處死后,乙醇浸泡5 min,在無菌條件下,剪開大鼠胸腔,剝離大鼠胸主動脈;收集主動脈并清除胸主動脈內(nèi)膜、外膜,留取中膜組織,將其剪成大小均勻的組織切塊,加入胰蛋白酶消化液進行消化(2倍體積)20 min后,放入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM中于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。隔天換液1次,待細胞融合成80%～90%時進行傳代繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞達到指數(shù)增長期時開始實驗。

1.3.2 益氣活血通絡(luò)方含藥血清的制備

將12只大鼠隨機分為空白組、益氣活血通絡(luò)方組,每組6只。益氣活血通絡(luò)方組大鼠給予益氣活血通絡(luò)方灌胃,空白組灌胃等量生理鹽水,連續(xù)灌胃7 d。末次給藥1 h后,戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動脈取血(無菌條件下),分離血清,56 ℃水浴滅活30 min,-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖

VSMCs以5×103個/孔的濃度接種到96孔板中,待細胞貼壁后更換不同濃度含藥大鼠血清(0、5%、10%、20%、40%、80%)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),培養(yǎng)14 d后,每孔加入20 μL的CCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中孵育4 h,使用酶標儀檢測450 nm波長下各孔吸光度值,計算各組細胞存活率;細胞存活率(%)=(實驗組吸光度值-空白孔吸光度值)/(對照組吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.3.4 實驗分組及處理

將細胞以2.5×104個/孔的密度接種于24孔板中,于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。當VSMCs在培養(yǎng)基中的融合度為80%時,更換不含胎牛血清的培養(yǎng)基同步化24 h。采用β-GP誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs,建立鈣化模型,實驗設(shè)置8組,對照組用含20%正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基(1 600 μL DMEM培養(yǎng)基+400 μL正常大鼠血清)進行常規(guī)培養(yǎng);模型組待細胞長至80%融合后,更換為鈣化培養(yǎng)基(1 600 μL含有10 mmol 高磷(β-GP)的DMEM培養(yǎng)基+400 μL正常大鼠血清)進行培養(yǎng);益氣活血通絡(luò)方低劑量組,用含10%含藥大鼠血清的培養(yǎng)基(1 600 μL含有10 mmol β-GP的DMEM培養(yǎng)基+200 μL正常大鼠血清+200 μL含藥大鼠血清)進行培養(yǎng);益氣活血通絡(luò)方高劑量組,用含20%含藥大鼠血清的培養(yǎng)基(1 600 μL含有10 mmol β-GP的DMEM培養(yǎng)基+400 μL含藥大鼠血清)進行培養(yǎng);益氣活血通絡(luò)方+陰性對照質(zhì)粒(sh-Klotho)組,用含20%含藥大鼠血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并用Lipofectamine 2000按照說明書將100 nmol sh-Klotho轉(zhuǎn)染VSMCs;益氣活血通絡(luò)方+陰性對照質(zhì)粒(sh-NC)組,用含20%含藥大鼠血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并用Lipofectamine 2000將100 nmol sh-NC轉(zhuǎn)染VSMCs;益氣活血通絡(luò)方+成纖維細胞生長因子23基因過表達腺病毒(Ad-FGF23)組,用含20%含藥大鼠血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并用Lipofectamine 2000將100 nmol Ad-FGF23重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染VSMCs;益氣活血通絡(luò)方+重組腺病毒空載體(AdLaz)組,用含20%含藥大鼠血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并用Lipofectamine 2000將AdLaz重組腺病毒空載體轉(zhuǎn)染VSMCs作為對照。

1.3.5 VSMCs鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定:常規(guī)傳代培養(yǎng)VSMCs時在倒置相差顯微鏡下觀察VSMCs生長情況。免疫熒光鑒定α-SMA:取第3代VSMCs,以2.5×104個/孔的密度接種于24孔板中,于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h棄去培養(yǎng)基,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后,4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗滌,在含10%山羊血清和0.3%TritonX-100的PBS中室溫封閉1 h,然后與一抗α-SMA(1∶100)4 ℃孵育過夜,PBS洗去一抗,加入Alexa Fluor?488標記的山羊抗兔熒光二抗(1∶500)避光孵育2 h,PBS洗滌,DAPI染核,熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6 茜素紅S染色觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況

將VSMCs按照1.3.4項中步驟進行分組與處理。培養(yǎng)14 d后棄去培養(yǎng)液,細胞用PBS洗滌2次,并在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min。棄去多聚甲醛,PBS洗滌后在37 ℃下用0.1%茜素紅染液染色1 h。顯微鏡下觀察并拍照,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計鈣化結(jié)節(jié)染色陽性區(qū)域的面積。

1.3.7 細胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)濃度、ALP活性測定

將VSMCs按照1.3.4項中步驟進行分組與處理。培養(yǎng)14 d后,裂解細胞,離心,取上清液為樣品。按照Ca2+濃度檢測試劑盒說明書的操作步驟加入檢測試劑以確定610 nm處的OD值。根據(jù)標準品濃度繪制標準曲線,計算各組細胞中Ca2+的含量。通過二喹啉甲酸(BCA)法檢測細胞中的總蛋白含量,用每孔中蛋白含量標化Ca2+含量。使用ALP活性檢測試劑盒測量上清液中ALP活性,于405 nm處測定各組OD值,使用對硝基苯酚繪制標準曲線;并將每個樣品的ALP活性標化為相應(yīng)的總蛋白含量。

1.3.8 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)檢測細胞Klotho、FGF23、α-SMA、RUNX2、BMP2的mRNA表達

用Trizol提取細胞中的總RNA,按照試劑盒說明書步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行PCR擴增。反應(yīng)體系(20 μL):cDNA(200 ng/μL)2 μL,SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μL,正反向引物各0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對含量。引物序列見表1。

1.3.9 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測細胞Klotho、FGF23、α-SMA、RUNX2、BMP2的蛋白表達

使用RIPA裂解液提取細胞中蛋白質(zhì)。使用BCA試劑盒對蛋白質(zhì)濃度進行定量。取等量蛋白質(zhì)樣品上樣(30 μg),十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì),并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。5%脫脂牛奶封閉,并在4 ℃下與一抗(Klotho、FGF23、α-SMA、RUNX2、BMP2、β-actin,1∶1 000)孵育過夜。第2天,將膜與山羊抗兔IgG H&L孵育(1∶2 000)2 h,然后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)進行顯色。以β-actin為內(nèi)參分析結(jié)果。以上所有實驗均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 VSMCs的鑒定

顯微鏡下可見原代培養(yǎng)3～5 d時,有少量VSMCs從組織中爬出;培養(yǎng)7～9 d時細胞呈長梭形,放射性生長,并在培養(yǎng)9 d后呈現(xiàn)出“峰-谷”狀特征。“峰”處細胞較多,疊層;“谷”處細胞較少,有時僅為單層細胞甚至無細胞(見圖1)。免疫熒光結(jié)果顯示VSMCs中α-SMA沿長軸呈肌絲狀排列于細胞質(zhì)內(nèi)(見圖2)。

圖1 VSMCs形態(tài)學(xué)變化(×200)

2.2 各組細胞增殖活力

用不同濃度的益氣活血通絡(luò)方含藥血清培養(yǎng)VSMCs,干預(yù)14 d后采用CCK-8法檢測細胞存活率。結(jié)果顯示,與對照組比較,益氣活血通絡(luò)方含藥血清濃度為5%、10%和20%時細胞存活率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),益氣活血通絡(luò)方含藥血清濃度為40%、80%時細胞存活率明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。因此,本研究選擇10%和20%含藥血清濃度進行后續(xù)實驗。

表2 不同濃度的益氣活血通絡(luò)方含藥血清對細胞活性的影響(±s) 單位:%

2.3 各組細胞茜素紅S染色結(jié)果

茜素紅S染色結(jié)果顯示,β-GP可誘導(dǎo)VSMCs中的鈣化結(jié)節(jié)。與對照組比較,模型組可見橘紅色鈣化結(jié)節(jié)明顯增多,鈣化結(jié)節(jié)面積明顯增加(P<0.05);與模型組比較,益氣活血通絡(luò)方低劑量組、益氣活血通絡(luò)方高劑量組鈣化結(jié)節(jié)明顯減少,鈣化結(jié)節(jié)面積明顯降低(P<0.05);與益氣活血通絡(luò)方高劑量組比較,益氣活血通絡(luò)方+sh-Klotho組、益氣活血通絡(luò)方+Ad-FGF23組鈣化結(jié)節(jié)明顯增多,鈣化結(jié)節(jié)面積明顯增加(P<0.05)。詳見圖3、表3。

圖3 各組大鼠茜素紅S染色結(jié)果(×200)

表3 各組細胞鈣結(jié)節(jié)面積比較(±s) 單位:mm2

2.4 各組細胞中Ca2+濃度和ALP活性比較

與對照組比較,模型組細胞中Ca2+濃度和ALP活性明顯增加(P<0.05);與模型組比較,益氣活血通絡(luò)方低、高劑量組Ca2+濃度和ALP活性明顯降低(P<0.05);與益氣活血通絡(luò)方高劑量組比較,益氣活血通絡(luò)方+sh-Klotho組、益氣活血通絡(luò)方+Ad-FGF23組Ca2+濃度和ALP活性明顯增加(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組細胞Ca2+濃度和ALP活性比較(±s)

2.5 各組細胞中Klotho、FGF23、α-SMA、RUNX2、BMP2的mRNA水平比較

與對照組比較,模型組細胞中Klotho、α-SMA的mRNA水平明顯降低,FGF23、RUNX2、BMP2的mRNA水平明顯增加(P<0.05);與模型組比較,益氣活血通絡(luò)方低、高劑量組細胞中Klotho、α-SMA的mRNA水平明顯增加,FGF23、RUNX2、BMP2的mRNA水平明顯降低(P<0.05);與益氣活血通絡(luò)方高劑量組比較,益氣活血通絡(luò)方+sh-Klotho組、益氣活血通絡(luò)方+Ad-FGF23組細胞中Klotho、α-SMA的mRNA水平明顯降低,FGF23、RUNX2、BMP2的mRNA水平明顯增加(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組細胞Klotho、FGF23、α-SMA、RUNX2、BMP2的mRNA表達水平比較(±s)

2.6 各組細胞中Klotho、FGF23、α-SMA、RUNX2、BMP2的蛋白表達比較

與對照組比較,模型組細胞中Klotho、α-SMA的蛋白表達明顯降低,FGF23、RUNX2、BMP2的蛋白表達明顯增加(P<0.05);與模型組比較,益氣活血通絡(luò)方低、高劑量組細胞中Klotho、α-SMA的蛋白表達明顯增加,FGF23、RUNX2、BMP2的蛋白表達明顯降低(P<0.05);與益氣活血通絡(luò)方高劑量組比較,益氣活血通絡(luò)方+sh-Klotho組、益氣活血通絡(luò)方+Ad-FGF23組細胞中Klotho、α-SMA的蛋白表達明顯降低,FGF23、RUNX2、BMP2的蛋白表達明顯增加(P<0.05)。詳見圖4、表6。

圖4 各組細胞中Klotho、FGF23、α-SMA、RUNX2、BMP2的蛋白表達條帶圖(A為對照組;B為模型組;C為益氣活血通絡(luò)方低劑量組;D為益氣活血通絡(luò)方高劑量組;E為益氣活血通絡(luò)方+sh-NC組;F為益氣活血通絡(luò)方+sh-Klotho組;G為益氣活血通絡(luò)方+AdLaz組;H為益氣活血通絡(luò)方+Ad-FGF23組)

表6 各組細胞Klotho、FGF23、α-SMA、RUNX2、BMP2的蛋白表達比較(±s)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認為,慢性腎病屬于“腎風(fēng)”“關(guān)格”“水腫”等范疇,該病病位在腎,但常累及脾臟,是脾腎功能失調(diào)共同作用的結(jié)果[11]。腎病日久,導(dǎo)致腎氣不足,氣不行血,致血瘀阻絡(luò),脈絡(luò)阻塞,水濕內(nèi)蘊體內(nèi),日久化濁,脾虛運化失司,濕濁尿毒不得下泄。故補益脾腎、活血通絡(luò)、祛邪降濁為本病重要的治療原則[12]。益氣活血通絡(luò)方由黃芪、丹參、當歸、赤芍、紅花、桃仁、川芎、地龍組成,其中黃芪補脾益腎氣、利尿固表、益氣行血化瘀,為君藥。丹參祛瘀止痛、活血涼血;川芎為血中之氣藥,可祛風(fēng)止痛、活血行氣;當歸活血化瘀、補血養(yǎng)血,共為臣藥,可行氣活血、化瘀止痛、祛風(fēng)通絡(luò)。加赤芍、桃仁、紅花、地龍可活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、利尿消腫。全方配伍共起脾腎共補、益氣活血、通絡(luò)祛濕之效。現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn),黃芪及其提取物黃芪甲苷Ⅳ可激活自噬,對慢性腎小球腎炎具有保護作用[13];地龍可抑制腎小球系膜細胞增殖,降解細胞外基質(zhì),防止腎小球硬化的發(fā)生和發(fā)展[14]。以上提示,益氣活血通絡(luò)方對慢性腎病的腎功能具有改善作用,而其對慢性腎病病人的血管鈣化是否具有改善作用還未可知。本研究采用β-GP誘導(dǎo)VSMCs鈣化,發(fā)現(xiàn)益氣活血通絡(luò)方可明顯減少β-GP誘導(dǎo)的VSMCs中鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積,并降低VSMCs中Ca2+濃度和ALP活性,同時伴隨著VSMCs標志物(如α-SMA)的上調(diào)和成骨標志物(如RUNX2、BMP2)的下調(diào),提示益氣活血通絡(luò)方可抑制高磷環(huán)境中VSMCs向成骨表型分化,減輕VSMCs的鈣化。Klotho和FGF23是腎功能不全時礦物質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[15]。研究顯示,慢性腎病領(lǐng)域的Klotho和FGF23與無機磷酸鹽體內(nèi)平衡密切相關(guān)[16]。研究顯示,在慢性腎病中,Klotho水平下降,FGF23水平升高[17-18]。Klotho蛋白主要在遠端腎小管上皮細胞中表達,可調(diào)節(jié)尿鈣、鉀、磷的排泄;也是FGF23發(fā)揮生物學(xué)活性必需的輔助因子,在血管鈣化中發(fā)揮重要作用,臨床研究發(fā)現(xiàn),血清Klotho水平降低是主動脈鈣化的預(yù)測指標[19]。FGF23是一種磷酸調(diào)節(jié)激素,主要作用于腎臟和甲狀旁腺,隨著腎功能的下降,FGF23水平增加,這與慢性腎臟疾病中的血管鈣化和死亡率有關(guān)[20]。研究發(fā)現(xiàn),血管Klotho缺乏會促進人類動脈鈣化的發(fā)展,并介導(dǎo)對FGF23的抵抗[21];改善Klotho/FGF23軸可減緩慢性腎病的進展[22]。但是FGF23對VSMCs促進或抑制鈣化的潛在作用仍存在爭議,一些研究者發(fā)現(xiàn)FGF23直接增加VSMCs鈣化[23];另有研究者強調(diào)FGF23不參與該過程[24];而對于FGF23是否促進VSMCs表型的改變尚未明確。本研究結(jié)果顯示,在β-GP誘導(dǎo)VSMCs鈣化的過程中,Klotho的mRNA和蛋白表達明顯降低,FGF23的表達明顯升高,而益氣活血通絡(luò)方可上調(diào)Klotho的表達,下調(diào)FGF23的表達,推測益氣活血通絡(luò)方對高磷環(huán)境中VSMCs向成骨表型分化的抑制作用可能與Klotho/FGF23軸有關(guān)。為了驗證此推測,本研究在益氣活血通絡(luò)方干預(yù)的基礎(chǔ)上,使用sh-Klotho或Ad-FGF23進一步轉(zhuǎn)染VSMCs來下調(diào)Klotho或上調(diào)FGF23表達,結(jié)果顯示,降低Klotho表達和上調(diào)FGF23表達可減弱益氣活血通絡(luò)方對高磷環(huán)境中VSMCs向成骨表型分化的抑制作用,提示益氣活血通絡(luò)方可能通過上調(diào)Klotho的表達,下調(diào)FGF23的表達激活Klotho/FGF23軸,進而抑制高磷環(huán)境中VSMCs向成骨表型分化。

綜上所述,益氣活血通絡(luò)方可抑制高磷環(huán)境中VSMCs向成骨表型分化,減輕VSMCs的鈣化,其作用機制可能與激活Klotho/FGF23軸有關(guān)。但由于體內(nèi)外環(huán)境的差異較大,在體內(nèi)益氣活血通絡(luò)方是否發(fā)揮相同的作用尚有待進一步研究。