基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探討大黃-三七配伍治療腦出血機制及其實驗驗證

李艷嬌,李雙陽,唐紅梅,白 雪

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是臨床常見疾病,是全球范圍內(nèi)致死、致殘的主要原因之一,2007—2017年,全球范圍內(nèi)腦出血住院人數(shù)增加18%,1990—2010年,全球腦出血發(fā)病率上升約47%[1]。發(fā)病后,高達50%～70%的存活病人中遺留有腦卒中后遺癥,為全球醫(yī)療保健帶來了沉重的負擔[2]。目前,針對腦出血主要為西醫(yī)治療、中醫(yī)治療、中西醫(yī)結合治療,其中,以中西醫(yī)結合治療效果最佳。中醫(yī)藥具有多通路、多靶點、副作用少的特點,在臨床上的應用較廣泛[3]。腦出血在中醫(yī)學歸屬于“中風”范疇,其病機主要涉及風、火、痰、瘀、虛,證型包括風火證、痰瘀證、氣虛證、陰虛陽亢證等,其中,痰瘀論、火熱論一直是眾多醫(yī)家的關注重點,故治療多以活血化瘀、通腑瀉熱為主[4]。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載:“大黃味苦,寒,無毒,主下瘀血,血閉,寒熱,破癥瘕積聚,留飲,宿食,蕩滌腸胃,推陳致新,通利水谷,調(diào)中化食,安和五臟。”言大黃具有清熱瀉火通腑、活血化瘀之效;《本草求真》記載:“三七,世人僅知功能止血住痛,殊不知因血瘀而痛作,血因敷散而血止。三七氣味苦溫,能于血分化而血瘀。”闡明三七具有化瘀止血、活血定痛之功。臨床研究亦表明,大黃-三七藥對可延緩腦出血后病理進展,顯著提高病人治療療效,降低致殘率、病死率[5-8]。故本研究擬運用網(wǎng)絡藥理學、分子對接的方法對大黃-三七配伍治療腦出血的作用機制進行研究,為后續(xù)研究的開展提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學預測大黃-三七藥對治療腦出血作用機制

1.1.1 大黃、三七化合物與靶標的獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分別查找大黃、三七,以口服生物利用度(oral bio-availability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為條件進行化合物篩選,并進行文獻補充。

使用有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)對篩選后的活性成分進行對比確認后保存其蛋白的3D結構,對于PubChem未收錄的成分通過Chemdraw繪制,并保存為3D格式。將以上成分的3D結構導入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫,物種限定為人“homo sapiens”,以可能性(probability)≥0篩選獲得藥物活性成分靶點,對于Swiss Target Prediction無靶點信息的成分通過TCMSP進行補充,并運用UniProt(https://www.uniprot.org/)獲取靶標對應的基因名稱。

1.1.2 腦出血疾病基因獲取

以“cerebral hemorrhage”為關鍵詞從人類基因綜合數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/,GeneCards)在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/,OMIM)、治療靶點數(shù)據(jù)庫(https://db.idrblab.net/ttd/,TTD)獲取腦出血疾病基因,將檢索出的疾病靶點進行整合、刪選、去掉重復值,獲得關于腦出血疾病相關靶點數(shù)據(jù)庫。運用Venn工具獲取藥物活性成分-疾病交集靶點,所得的交集靶點即為大黃-三七有效活性成分可能作用于腦出血疾病的相關靶點。

1.1.3 構建“疾病-中藥-化合物-交集基因”網(wǎng)絡圖

獲取交集基因后,運用Cytoscape 3.7.1軟件繪制“疾病-中藥-化合物-交集基因”網(wǎng)絡圖,根據(jù)軟件所提供的“network analyzer”板塊進行網(wǎng)絡拓撲學分析,依據(jù)度值和介度中心性,獲得核心成分以及核心靶點。

1.1.4 蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡的構建

將所得交集基因輸入STRING(https://stringdb.org/)數(shù)據(jù)分析平臺進行PPI分析,數(shù)據(jù)分析模式設定為“multiple proteins”,物種限制為“homo sapiens”。最低相互作用評分設置為高等置信度[medium confidence(0.900)],隱藏網(wǎng)絡中無聯(lián)系的節(jié)點,其余參數(shù)保持默認設置導出TSV文件。最后運用Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡,使用軟件所提供的“network analyzer”板塊進行網(wǎng)絡拓撲學分析,依據(jù)度值和介度中心性獲得核心蛋白。

1.1.5 基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析

將交集基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)平臺(https://metascape.org/)進行富集分析,并對結果運用在線作圖工具微生信(http://www.bioinformatics.com.com.cn/)行可視化轉(zhuǎn)化。

1.2 動物實驗驗證

1.2.1 動物

選取無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠18只,鼠齡8～12周,體質(zhì)量250～280 g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證:NO.SCXK(遼)2020-0001,由西南醫(yī)科大學實驗動物研究中心飼養(yǎng),標準環(huán)境下飼養(yǎng),實驗溫度20～24 ℃,濕度30%～40%,投以普通大鼠飼料,自由攝食以及飲水。

1.2.2 藥物制備

三七、生大黃購于西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房,取生大黃與三七,分別研細末,過中藥六號篩后,按生大黃、三七7∶3比例混合制得大黃三七散,用生理鹽水將大黃三七散制成20 mg/mL的濃縮液。

1.2.3 主要試劑

Ⅶ-S膠原酶(Sigma公司);骨蠟(美國強生公司);兔抗磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)單隆抗體(Abcam公司);兔抗磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(p-AKT1)單隆抗體(Cell Signaling公司);兔抗絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)單隆抗體(碧云天公司);兔抗Bcl-2家族抗凋亡蛋白(Bcl xL)單克隆抗體(碧云天公司)、兔抗Bax單克隆抗體(碧云天公司);過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(BioX公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(UE公司);實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒(UE公司);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天公司);原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(TUNEL)試劑盒(碧云天公司)。

1.2.4 主要儀器與設備

大鼠腦立體定位儀(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司);BY-400C低速離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司);SLFAD自動酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);-80 ℃超低溫冰箱(美國賽默飛世爾公司);IMS-40全自動雪花制冰機(常熟市雪珂電器有限責任公司);DYY-10C電泳儀(北京六一儀器廠);ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.2.5 造模及模型評估

大鼠稱重后以1 mL/kg劑量腹腔注射3%戊巴比妥進行麻醉,用腦立體定位儀將大鼠俯臥位固定鼠頭,常規(guī)備皮及消毒后,沿頭皮正中縱向切開約1 cm,用30%過氧化氫腐蝕骨膜使前囟及冠狀縫充分暴露,調(diào)節(jié)定位儀X軸、Y軸坐標以定位尾殼核區(qū)域,使針尖垂直于矢狀縫右側3.0 mm、前囟前0.8 mm處,用三棱針在針尖下鉆開顱骨,以顱骨外板為零點調(diào)節(jié)定位儀Z軸,進針深度為5.5 mm,以0.1 U/min勻速緩慢注入膠原酶0.5 U,留針約10 min后緩慢退針,用骨蠟將鉆孔封閉,術后頭皮常規(guī)縫合消毒。假手術組僅進針不注入膠原酶,術后按照Zea Longa 5分法[9]對大鼠進行神經(jīng)功能評分,無神經(jīng)功能缺損癥狀為0分;提尾倒掛使血腫對側前肢緊貼胸壁或不能伸展為1分;行走時向一側轉(zhuǎn)圈追尾,且血腫對側前肢長拖或蜷縮,或有上述1分癥狀伴輕推時癱側抵抗力減弱為2分;行走或站立時向血腫對側傾倒為3分;意識障礙,不能行走為4分,評分為1～3分則認為造模成功,可納入實驗。

1.2.6 分組與給藥

18只SD雄性大鼠適應性喂養(yǎng)2 d后,隨機分為假手術組、模型組、中藥組,每組6只,其中,假手術組僅開顱不注射膠原酶,模型組腦內(nèi)注射膠原酶造模,以上兩組術前30 min給予生理鹽水2 mL灌胃1次,造模后每天使用生理鹽水2 mL灌胃1次,連續(xù)灌胃4 d;中藥組根據(jù)文獻[10]于造模前30 min以60 mg/kg劑量予以大黃-三七散2 mL灌胃,并于造模后連續(xù)灌胃4 d。

1.2.7 標本采集

大鼠給藥4 d后禁食12 h,稱重后予以腹腔注射3%戊巴比妥至深度麻醉,右心耳生理鹽水灌注后快速取出腦組織,切取出血側大腦半球置于試管后迅速置于-80 ℃保存腦組織。

1.2.8 檢測指標

1.2.8.1 神經(jīng)功能評分

Zea Longa 5分法[9]對大鼠進行神經(jīng)功能評分。

1.2.8.2 HE染色觀察大鼠腦組織病理改變

石蠟切片脫蠟復水,蘇木精進行染色10 min,自來水沖洗,鹽酸乙醇分化10 s,自來水沖洗;伊紅染色3 min,自來水沖洗;脫水、透明、中性樹膠封片,晾干后觀察血腫周圍腦組織病理改變,拍照并保存。

1.2.8.3 TUNEL檢測大鼠腦組織細胞凋亡水平

石蠟切片脫蠟復水;切片滴加蛋白酶K,37 ℃避光孵育30 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌;加TUNEL檢測液,37 ℃避光孵育60 min,PBS洗3次;dapi核染,避光孵育10 min,PBS洗3次;封片后觀察,拍照并保存。

1.2.8.4 RT-qPCR檢測大鼠腦組織中PI3K、AKT1、Bax、Bcl xL的mRNA表達水平

取-80 ℃腦組織,用Trizol法提取總RNA后,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄后按95 ℃ 5 min預變性,40個循環(huán)(變性95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 25 s)對PI3K、AKT1、Bax、Bcl xL進行RT-qPCR擴增,用熒光定量PCR儀進行常規(guī)溶解曲線分析測定CT值,以2-ΔΔCT的計算值作為相對表達水平。引物序列見表1。

表1 RNA引物序列

1.2.8.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測大鼠腦組織中PI3K、AKT1、p-AKT1、Bax、Bcl xL蛋白表達水平

取0.1 g腦組織加入細胞裂解液并提取蛋白,二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白濃度,取50 μg總蛋白進行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后,脫脂奶粉封閉處理1 h,分別加入PI3K(1∶1 000)、AKT1一抗(1∶1 000)、p-AKT一抗(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl xL(1∶1 000)、β-actin一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,洗滌后避光顯影。

1.3 分子對接

將PPI獲得的核心蛋白作為分子對接的潛在靶點,獲得的潛在靶點分別與大黃-三七核心成分做分子對接。在TCMSP網(wǎng)站下載化合物的結構式(mol2格式),經(jīng)AutoDuckTools(v1.5.6)加全氫、設置為配體、檢測扭轉(zhuǎn)鍵、選擇扭轉(zhuǎn)鍵,最終導出為“pdbqt”格式文件;利用藥物綜合數(shù)據(jù)庫(http://www1.rcsb.org/,PDB)蛋白數(shù)據(jù)庫獲得潛在靶點結構的PDB格式文件,利用PyMol(v2.3.0)將潛在蛋白與原始配體分離并去除水分子,然后將處理后的蛋白經(jīng)AutoDuckTools(v1.5.6)加全氫,設置為大分子,導出為“pdbqt”格式文件;使用AutoDuckTools(v1.5.6)對處理后的靶蛋白、化合物進行分子對接,對接結果使用PyMol(v2.3.0)進行可視化分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 大黃、三七化合物與靶標的獲取

共獲得大黃活性成分16個、三七活性成分8個,其中,含共有成分1個;參考文獻[11-16]補充大黃、三七各4個活性成分,共獲得31個活性成分。31個活性成分用Swiss Target進行靶點預測,其中,蘆薈、大黃素和兒茶素無靶點信息,故通過TCMSP進行補充,靶點基因去重后共486個基因。詳見表2。

表2 大黃、三七活性成分信息

2.2 腦出血疾病基因及藥物共同基因獲取

檢索GeneCards、OMIM、TTD疾病數(shù)據(jù)庫,獲得關于腦出血靶點信息共3 870個,經(jīng)篩選、整合、去重后獲得靶點1 128個,與藥物靶點對比后獲得兩者的交集基因130個。詳見圖1。

圖1 “藥物-疾病”靶點韋恩圖

2.3 “疾病-藥物-化合物-交集基因”網(wǎng)絡圖

利用Cytoscape 3.7.1繪制“疾病-藥物-化合物-交集基因”網(wǎng)絡圖,共獲得164個節(jié)點(包含130個靶點、31個活性成分、2個藥物、1個疾病)與554條關系,以度值和介度中心性作為拓撲分析的主要參考依據(jù),排名居前5位的中藥活性成分分別是槲皮素、澤蘭黃醇、食脂素、大黃素甲醚、大黃酚,這些可能是大黃-三七配伍治療腦出血的關鍵成分;排名居前5位的靶點分別是雌激素受體1(ESR1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、Bcl2樣蛋白1(BCL2L1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA),這些體現(xiàn)了中藥治療疾病多成分、多靶點的作用機制。詳見圖2。

圖2 “疾病-藥物-化合物-交集基因”網(wǎng)絡圖

2.4 PPI網(wǎng)絡的構建

將所得交集基因輸入STRING數(shù)據(jù)分析平臺,進行蛋白相互作用分析后,再用Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI圖。網(wǎng)絡圖中包含112個節(jié)點、491條邊,圖中圓形節(jié)點代表每個基因蛋白,邊代表連接的2個蛋白有相互作用關系。按照度值、介度中心性作為拓撲分析的主要參考依據(jù),獲得互作關系排名前7位的蛋白分別為信號轉(zhuǎn)導激活轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)、酪氨酸激酶(SRC)、絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、腫瘤蛋白p53(TP53)、磷脂酰肌醇3激酶α亞單位(PI3KCA)、Harvey肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)、AKT1。詳見圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡圖

2.5 GO富集以及KEGG通路富集分析結果

運用Metascape進行GO富集分析后共獲得符合篩選標準的條目2 137條,其中,分子功能(molecular function,MF)157條、生物過程(biological process,BP)1 835條、細胞組分(cellular component,CC)145條,選取富集結果排名前10位的條目進行可視化分析,圖中Y軸代表P以10為底的負對數(shù),Y軸越高,所對應的P值越小,其中,MF主要涉及與酶、蛋白、受體結合等;BP主要包括細胞遷移以及細胞成分運動的正向調(diào)節(jié)、細胞對氮化合物的反應、轉(zhuǎn)移酶、激酶活性的正向調(diào)節(jié)等。詳見圖4。

圖4 GO富集分析結果

運用Metascape進行KEGG分析,共獲得符合篩選標準的條目188條,選取富集結果排名前20位的條目進行可視化,圖中氣泡代表富集的基因數(shù),顏色代表P以10為底的負對數(shù),顏色越深,所對應的P值越小。與腦出血相關的涉及PI3K/AKT信號通路、Rap1信號通路、晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路等。將前20條通路及對應交集基因?qū)隒ytoscape進行可視化分析,靶點在PI3K/AKT信號通路、Rap1信號通路、MAPK信號通路富集的較多,較多通路涉及靶點AKT1、PI3KCA、MAPK1、HRAS。詳見圖5、圖6。

圖5 KEGG富集分析

圖6 通路-靶點圖

2.6 實驗驗證結果

2.6.1 神經(jīng)功能評分

與假手術組比較,模型組大鼠給藥4 d后神經(jīng)功能評分明顯升高(P<0.001);與模型組比較,中藥組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.01),表明大黃-三七藥對可有效改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能評分。詳見圖7。

圖7 各組大鼠神經(jīng)功能評分結果 (n=6)(假手術組與模型組比較,＊ P<0.001;模型組與中藥組比較,# P<0.01)

2.6.2 腦血腫面積

假手術組大鼠腦組織無明顯血腫,與假手術組比較,模型組大鼠腦組織出現(xiàn)較大面積血腫,與模型組比較,中藥組大鼠血腫面積明顯縮小。詳見圖8。

圖8 各組大鼠腦出血4 d后血腫面積變化(n=3)

2.6.3 HE染色

假手術組大鼠腦組織未見明顯病理改變;模型組大鼠腦組織可見局部壞死、出血,神經(jīng)元變性、水腫以及炎性細胞浸潤等病理變化,與模型組比較,中藥組大鼠腦組織病理損害程度明顯減輕。詳見圖9。

圖9 HE染色結果

2.6.4 TUNEL熒光染色

與假手術組比較,模型組大鼠腦組織凋亡細胞明顯增多(P<0.01),與模型組比較,中藥組大鼠腦組織凋亡細胞明顯減少(P<0.05)。詳見圖10、圖11。

圖10 TUNEL熒光染色結果(×200)

圖11 各組大鼠細胞凋亡率比較(n=3)

2.6.5 各組大鼠腦組織PI3K、AKT1、Bax、Bcl xL mRNA表達水平比較

與假手術組比較,模型組大鼠腦組織PI3K、AKT1、Bcl xL mRNA表達水平明顯降低,Bax mRNA表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,中藥組大鼠腦組織PI3K、AKT1、Bcl xL mRNA表達水平升高,Bax mRNA水平明顯降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織PI3K、AKT1、P-AKT1、Bax、Bcl xL mRNA表達水平比較(±s)

2.6.6 各組大鼠腦組織PI3K、AKT1、p-AKT1、Bax、Bcl xL蛋白表達水平比較

與假手術組比較,模型組大鼠腦組織PI3K、p-AKT1、Bcl xL蛋白表達水平明顯降低,Bax蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,中藥組大鼠腦組織PI3K、p-AKT1、Bcl xL蛋白表達水平升高,Bax蛋白水平明顯降低(P<0.05)。說明大黃-三七藥對可提高腦出血大鼠腦組織PI3K、AKT1以及抗凋亡蛋白Bcl xL蛋白表達水平,降低促凋亡蛋白Bax蛋白表達水平,通過激活PI3K/AKT通路,減少神經(jīng)元凋亡,從而保護腦組織。詳見表4、圖12。

圖12 各組大鼠腦組織PI3K、p-AKT1、AKT1、Bcl xL、Bax蛋白表達條帶圖

表4 各組大鼠腦組織PI3K、AKT1、p-AKT1、Bax、Bcl xL蛋白表達水平比較(±s)

2.7 分子對接結果

將核心成分與潛在靶點使用AutoDuckTools(v1.5.6)進行分子對接,該軟件通過結合能評估配體與受體的結合能力,即計算最低結合能,<-17.78 kJ/mol代表有一定的結合力,<-20.92 kJ/mol代表兩者結合性較好,<-29.29 kJ/mol代表兩者有強烈結合。結果顯示,核心成分與潛在靶點大部分均能較好結合。詳見表5、圖13。

表5 分子對接結果 單位:kJ/mol

3 討 論

腦出血病理過程復雜,主要涉及發(fā)病早期血腫直接壓迫造成的原發(fā)性損傷以及后期血腦屏障破壞、腦水腫形成造成的繼發(fā)性腦損傷,涉及的機制包括小膠質(zhì)細胞活化、炎癥反應和氧化應激、細胞自噬與凋亡、神經(jīng)興奮性毒性、Ca2+離子超載、鐵沉積等[17-18]。腦出血中醫(yī)病機多為本虛標實證,本虛多因肝腎陰虧,氣血不足;標實多為風火痰瘀,相兼為患,一旦發(fā)病,則氣血逆亂,上沖于腦,痰瘀互結,腑氣不通,其腑實與血瘀是重點。中醫(yī)理論認為離經(jīng)之血便為瘀血。因此,盡管腦出血有出血癥狀,依據(jù)中醫(yī)理論亦當活血化瘀,治療上以化瘀通腑為要。而大黃能夠通腑瀉熱、蕩滌腸胃、活血化瘀,為通腑之要藥。《醫(yī)學衷中參西錄》言:“三七……善化瘀血,又善止血妄行,為血衄要藥。病愈后不至瘀血留于經(jīng)絡……化瘀血不傷新血,允為理血妙品”。因此,治療出血性腦卒中,醫(yī)家多用大黃-三七配伍,因大黃能破瘀通腑,化瘀而不傷正,三七止血化瘀,活血止痛,止血而不留瘀,一通一澀,達到不止血而血自止的目的。

臨床上,大黃-三七配伍治療腦出血取得了一定的進展,現(xiàn)代研究表明,大黃-三七藥對可通過保護血腦屏障、降低腦水腫、減輕炎癥反應、抗氧化、抗凋亡等途徑保護腦組織,從而改善神經(jīng)功能,減輕認知障礙[19-21]。但大黃-三七藥對治療腦出血的具體作用機制研究較少,故本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法,利用相應的數(shù)據(jù)庫和軟件,構建了網(wǎng)絡并對靶點進行了通路富集分析,初步挖掘和分析了大黃-三七配伍可能的作用機制,為臨床使用大黃-三七配伍治療腦出血提供更多依據(jù)。

3.1 藥物活性成分分析

研究提示,大黃-三七配伍治療腦出血中關鍵活性成分有槲皮素、澤蘭黃醇、食脂素、大黃素甲醚、大黃酚等。多項研究表示,槲皮素具有顯著的神經(jīng)相關益處,與其強大的抗炎抗氧化作用相關[22];動物實驗證明,槲皮素可顯著降低腦出血小鼠大腦炎性因子白介素1β(IL-1β)、白介素4(IL-4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及促凋亡相關蛋白Bax表達,通過抑制炎癥反應和減少神經(jīng)元凋亡,促進神經(jīng)功能恢復[23-24]。黃酮類化合物大黃素甲醚具有廣泛藥理作用,現(xiàn)代研究多集中在缺血缺氧、腦缺血再灌注等腦損傷的神經(jīng)保護作用的研究,其保護機制可能是通過降低IL-1β、TNF-α等炎性因子以及抑制細胞間黏附分子-1、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Caspase-3)、一氧化氮合酶等促凋亡蛋白基因的表達發(fā)揮作用[25-26]。研究顯示,大黃酚可通過調(diào)控核因子κB(NF-κB)、MAPK、PI3K/AKT等信號通路發(fā)揮抗炎、抗神經(jīng)元凋亡等作用以減少腦出血后神經(jīng)元的損傷[27]。其他關鍵成分澤蘭黃醇、食脂素現(xiàn)代藥理學研究較少,可作為今后探索的切入點。

3.2 關鍵靶點及通路生物進程分析

通過蛋白質(zhì)相互作用分析,獲得關鍵靶點STAT3、SRC、MAPK1、TP53、PIK3CA、HRAS、AKT1。通過KEGG信號通路分析,發(fā)現(xiàn)與腦出血密切相關的通路有PI3K/AKT信號通路、Rap1信號通路、AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路等。STAT3是一種蛋白質(zhì)編碼基因,通過調(diào)節(jié)相關通路,有效改善腦出血后炎癥反應以及氧化應激、減輕神經(jīng)細胞凋亡、促進血管生成等作用,成為神經(jīng)系統(tǒng)重要的保護因子[28];SRC家族激酶廣泛存在于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中,與調(diào)節(jié)增殖、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移以及骨代謝等過程相關,既往研究顯示,SRC磷酸化通過旁細胞途徑增加微血管通透性,參與血腦屏障損害后病理性通透性過程,抑制SRC活性能,有效保護血腦屏障,減輕腦水腫,改善神經(jīng)功能損傷[29];AKT參與細胞凋亡、增殖、血管新生等過程[30],包括AKT1、AKT2、AKT3亞型,AKT1主要存在于內(nèi)皮細胞,與調(diào)節(jié)細胞代謝、增殖、細胞存活、血管新生以及維持血管完整度緊密相關[31],PI3KCA是PI3K的催化亞基,可激活PI3K/AKT信號通路[32]。研究顯示,腦組織中PI3K/AKT信號通路通過調(diào)控血管生成基因表達以及抑制神經(jīng)元凋亡實現(xiàn)腦保護[33-34]。腦出血后,機體本身可以釋放能夠?qū)⒕哂欣野彼峒っ富钚允荏w激活的物質(zhì)如神經(jīng)細胞生長因子,受體經(jīng)過其磷酸化后可特異性的結合PI3K的調(diào)節(jié)亞基,從而將PI3K激活,AKT作為PI3K的下游效應因子,與PI3K結合后使發(fā)生磷酸化而激活,活化后的AKT可調(diào)控凋亡相關蛋白如Bax、Bcl xL以及血管生成因子表達,通過抗神經(jīng)元凋亡以及促進血管新生保護腦組織[35]。

3.3 分子對接及實驗驗證結果分析

分子對接結果顯示,大黃-三七藥物核心成分與篩選出的關鍵靶點大部分能較好地結合,體現(xiàn)了中醫(yī)藥多靶點、多通路的治療特點。本研究動物實驗顯示,大黃-三七藥對可有效降低腦出血大鼠神經(jīng)功能評分,減小血腫面積,改善腦組織病理損傷,升高腦出血大鼠腦組織PI3K、AKT1、Bcl xl表達,降低Bax表達,通過激活PI3K/AKT通路發(fā)揮抗凋亡作用,從而保護腦組織,改善神經(jīng)功能缺損。

綜上所述,大黃-三七配伍治療腦出血的主要成分可能有槲皮素、澤蘭黃醇、食脂素、大黃素甲醚、大黃酚,關鍵靶點蛋白主要有STAT3、SRC、MAPK1、TP53、PIK3CA、HRAS、AKT1,涉及的信號通路有PI3K/AKT信號通路、Rap1信號通路、AGE-RAGE 信號通路、MAPK信號通路,提示大黃-三七藥對治療腦出血可能與抗神經(jīng)細胞凋亡、抑制炎癥反應、促進血管新生等多個生物學過程有關,分子對接和動物實驗結果也進一步驗證了成分與靶點的相互作用,體現(xiàn)了中醫(yī)藥多成分、多靶點、多通路的特點,對闡明大黃-三七配伍治療腦出血的作用機制具有一定借鑒意義,但動物實驗驗證所選樣本量較少,所得結論仍需進一步實驗或臨床驗證。