麝香酮對膿毒血癥小鼠心肌損傷的作用機制研究

石亞其,雷玉華

膿毒血癥是一種由機體不良免疫反應引起的致死性綜合征,若不及時控制,可發展為全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),最終誘發多器官功能障礙(multiple organ dysfunction,MOD),甚至死亡[1]。膿毒血癥心肌損傷是膿毒血癥病人最常見且最嚴重的并發癥之一,可極大地增加膿毒血癥病人的死亡率,其中,心肌細胞炎癥、凋亡、焦亡及氧化應激的激活是膿毒血癥心肌損傷發生過程中的重要病理生理改變[2-3]。因此,靶向抑制上述過程,對減輕膿毒血癥心肌損傷及治療膿毒血癥具有重要意義。近年來,隨著藥物化學工藝技術的不斷提高,植物源性的中藥活性單體獲得臨床醫生的廣泛關注。麝香作為一種具有較高價值的中藥,在臨床上被廣泛應用于緩解心肌缺血[4]。此外,麝香保心丸被證實具有良好的抗炎作用[5]。麝香酮(muscone)為麝香的主要活性單體,可通過抑制炎癥改善心肌梗死后的心室重塑,研究顯示,麝香酮可通過抑制炎性小體的激活改善心肌梗死小鼠的心臟功能[6-7]。在膿毒血癥小鼠心肌組織中,NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)炎性小體表達被明顯激活,是導致心肌炎癥及心肌細胞焦亡的重要原因[8]。本研究通過構建脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠膿毒血癥心肌損傷模型,探討麝香酮對小鼠心功能、心肌炎癥及損傷的影響及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CD45(貨號:#ab25603)、NLRP3(貨號:#ab263899)、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)(貨號:#ab155970)、白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)(貨號:#ab71495)及磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(貨號:#ab181602)等一抗均購自美國Abcam公司;羊抗兔IgG二抗(批號:926-32211)購自美國LICOR公司;免疫組織化學3,3-二氨基苯聯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑盒(貨號:GK600710)購自美國Gene-tech公司;麝香酮(貨號:HY-N0633)購自上海Med Chem Express(MCE)公司,藥物純度≥98%。

1.2 實驗動物及膿毒血癥心肌損傷模型小鼠的建立

36只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠購于湖北省預防醫學科學院動物中心,實驗動物許可證號:SCXK(鄂)2015-0018,體質量240～300 g。按照隨機數表法將小鼠分為對照組、LPS組及LPS+麝香酮組,每組12只。LPS組和LPS+麝香酮組小鼠腹腔注射LPS 5 mg/kg以構建膿毒血癥心肌損傷模型[8],LPS+麝香酮組小鼠于LPS注射前7 d開始, 每日09:00給予2 mg/kg的麝香酮灌胃。LPS注射12 h后,LPS組小鼠出現精神萎靡、毛發豎立、腹瀉等表現,心臟超聲顯示心臟收縮及舒張功能明顯受損,則認為造模成功。

1.3 小鼠心臟功能評估

采用MyLab 30CV多普勒超聲診斷儀(深圳百勝醫療科技有限公司)檢測小鼠心功能。在靠近小鼠乳頭肌水平的胸骨旁短軸和胸骨旁長軸上以2D模式進行成像,依次記錄2D引導下的穿過左心室前壁和后壁的M型超聲,計錄各組小鼠的心率、左室射血分數(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。

1.4 免疫組織化學染色法檢測CD45陽性細胞浸潤情況

將心臟石蠟切片置于烘箱中進行烘干脫蠟,采用二甲苯及梯度濃度乙醇溶液對心臟切片進行分化脫水。用濃度為3%的過氧化氫-甲醇孵育15 min以抑制內源性過氧化物酶活性。用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)將CD45抗體以1∶200的比例進行稀釋,4 ℃孵育心臟切片并過夜。24 h后,加入二抗用DAB進行顯色。待顯色完成后,對各組小鼠心臟切片進行拍照并定量。

1.5 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應法(qRT-PCR)檢測促炎性細胞因子的mRNA表達

在低溫下,每組取20～30 mg心室肌組織剪碎并研磨提取總RNA。利用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度。對符合要求的樣本進行成纖維病毒逆轉錄酶(avian myeloblastosis virus,AMV)逆轉錄,隨后對各樣本進行實時熒光定量核酸擴增,以獲取cDNA。取各組樣本cDNA加60 μL 無酶無菌水稀釋后,配置成如下的反應體系:包括無酶無菌水8 μL,正向引物及反向引物各0.5 μL,SyB Green 10 μL。以GAPDH作為內參基因對各樣本中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的目的基因進行校正。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測炎性小體通路相關蛋白表達

提取各組小鼠心肌組織總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。電泳結束后,將凝膠中的蛋白進行轉膜,隨后分別用NLRP3、ASC、IL-18及GAPDH的一抗在4 ℃下孵育過夜。次日,于二抗(羊抗兔)稀釋液中避光孵育50 min。孵育結束后,使用Odyssey掃膜儀對各蛋白條帶掃描并定量,以GAPDH作為內參蛋白對各樣本目的蛋白進行校正。

1.7 血清心肌損傷標志物檢測

將各組小鼠血液樣本置于4 ℃、3 000×g離心15 min后儲存于-80 ℃冰箱中。使用全自動生化分析儀(ADVIA?2400,西門子,德國)檢測肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)及天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 3組小鼠心功能比較

與對照組比較,LPS組小鼠LVEF及LVFS明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+麝香酮組LVEF及LVFS明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組小鼠心功能比較(±s)

2.2 3組小鼠心肌組織CD45陽性細胞百分比及促炎性細胞因子mRNA表達比較

與對照組比較,LPS組小鼠TNF-α、IL-1β、HMGB1 mRNA表達量增加,CD45陽性細胞百分比升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+麝香酮組TNF-α、IL-1β、HMGB1 mRNA表達量降低,CD45陽性細胞百分比降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表3。

圖1 3組小鼠心肌組織CD45免疫組化染色(×200)

表3 3組小鼠心肌組織CD45陽性細胞百分比及促炎性細胞因子的mRNA表達比較(±s)

2.3 3組小鼠心肌損傷標志物比較

與對照組比較,LPS組小鼠血清CK-MB、LDH及AST水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+麝香酮組血清CK-MB、LDH及AST水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 3組小鼠心肌損傷標志物比較(±s)

2.4 3組小鼠心肌組織炎性小體通路相關蛋白表達比較

與對照組比較,LPS組NLRP3、ASC、IL-18蛋白表達量升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+麝香酮組NLRP3、ASC、IL-18蛋白表達量降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 3組小鼠心肌組織炎性小體通路相關蛋白表達條帶圖

表5 3組小鼠心肌組織炎性小體通路相關蛋白表達比較(±s)

3 討 論

膿毒血癥是指病原微生物入侵人體引起的全身炎癥反應綜合征,微生物的毒素和代謝產物進入血液循環后,可激活人體細胞和體液免疫系統,產生各種促炎性細胞因子[2]。膿毒血癥病人心肌細胞抑制是導致其心功能不全和血流動力學不穩定的重要因素,促炎性細胞因子引起的炎癥反應已被證實是誘發心肌細胞抑制的重要原因,但具體的分子機制尚未明確[1]。因此,以心肌細胞炎癥為靶點預防和治療膿毒血癥誘導的心功能不全及心肌損傷具有重要的臨床意義。

NLRP3在天然免疫調控中發揮重要的作用,近年來逐漸被重視。功能完整的NLRP3炎性小體包括3個重要元件,分別為NLRP3、Caspase-1和包含Caspase募集結構域的ASC[9]。LPS可通過多種機制活化NLRP3炎性小體促進促炎性細胞因子IL-1β和IL-18的成熟剪切及分泌,誘發機體局部或全身性炎癥反應。此外,其他的危險相關模式分子(danger-associated molecular patterns,DAMPs)如尿酸晶體、透明質酸、淀粉樣纖維、膽固醇晶體和組蛋白亦可激活NLRP3炎性小體,放大炎癥反應和組織損傷;病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)也可激活TLRs(Toll-like receptors)和NLRP3炎性小體,加重機體炎癥[10]。既往文獻報道,多種急慢性心肌疾病中NLRP3炎性小體均被激活,例如在心肌梗死所致的心肌重構中,心臟成纖維細胞中的NLRP3炎性小體被激活,而ASC或Caspase-1缺失可明顯減輕心臟成纖維細胞焦亡[11]。補體C5a可通過激活NLRP3炎性小體誘發膿毒血癥心肌損傷[12]。二氧化硫通過抑制大鼠NLRP3炎性小體激活減輕膿毒血癥引起的心功能障礙[13]。本研究結果顯示,LPS腹腔注射12 h后,小鼠心肌組織中心肌損傷標志酶CK-MB、LDH和AST的水平明顯升高,且LPS組小鼠心肌組織中NLRP3、ASC及IL-18的蛋白表達水平均明顯增高,相關促炎性細胞因子的mRNA表達水平也明顯增高,提示膿毒血癥心肌損傷中NLRP3介導的炎癥信號通路被激活。

麝香作為一種極具藥用價值的傳統中藥,被廣泛應用于心絞痛、血管性頭痛、腦卒中等心腦血管疾病的治療。麝香具有多種藥理活性,包括抗氧化、抗炎、血管擴張和血管生成作用。作為麝香中最重要的單體,體外實驗發現麝香酮對心肌缺血/再灌注損傷具有多重心臟保護作用。一方面,麝香酮可通過誘導蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)和內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的磷酸化發揮抗纖維化、抗炎和抗凋亡作用,減輕心肌缺血損傷[6];另一方面,麝香酮可通過阻斷心臟巨噬細胞中NLRP3炎性小體的激活改善心肌梗死小鼠心臟功能[8]。本研究結果顯示,麝香酮預處理可改善膿毒血癥小鼠心功能,提高膿毒血癥小鼠LVEF和LVFS,降低心肌損傷標志酶水平,抑制心肌炎癥反應及心肌損傷。進一步研究顯示,麝香酮可降低膿毒血癥小鼠心肌組織中NLRP3、ASC及IL-18的蛋白表達,表明在膿毒血癥心肌損傷模型中,麝香酮可能通過抑制NLRP3炎癥小體的激活發揮心肌保護作用。

綜上所述,麝香酮可通過抑制心肌組織中NLRP3炎性小體介導的炎癥激活,進而改善LPS誘導的膿毒血癥心肌損傷小鼠的心肌損傷及心功能,但仍需要進一步實驗研究探討其具體分子靶點。