皮層肌動蛋白表達(dá)水平與NSCLC患者M(jìn)VD及術(shù)后預(yù)后的關(guān)系

孫勇攀 龍謙 魯戰(zhàn)勝 周小江

(貴州省人民醫(yī)院胸外科,貴州 貴陽 550002)

肺癌是一種常見呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤,其中80%～85%的患者為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),發(fā)病率高居我國惡性腫瘤第一位〔1〕。盡管NSCLC的診斷和治療已取得了極大進(jìn)步和發(fā)展,但死亡率仍較高,其中術(shù)后復(fù)發(fā)是影響手術(shù)治療效果的重要因素〔2〕。隨著致癌機(jī)制、癌癥復(fù)發(fā)相關(guān)理論研究逐漸完善,侵襲與轉(zhuǎn)移屬于癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,可增加術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險〔3,4〕。皮層肌動蛋白(cortactin)屬于肌動蛋白結(jié)合蛋白,可富集于細(xì)胞的侵襲性偽足,從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的移動和腫瘤侵襲過程〔5〕。腫瘤血管新生是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵途徑,使惡性腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成為可能,其中以CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行腫瘤微血管密度(MVD)計數(shù),可反映腫瘤新生血管情況,既往研究亦證實,MVD與肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)及腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔6〕。目前,關(guān)于cortactin對于NSCLC患者術(shù)后預(yù)后評估價值尚不明確,本研究探討cortactin在NSCLC腫瘤組織中表達(dá)水平,并分析其與MVD及患者術(shù)后預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1基本資料 選取2016年5月至2018年9月于醫(yī)院行手術(shù)治療的140例NSCLC患者,于術(shù)中獲取肺癌組織及癌旁正常組織,癌旁正常組織距離腫瘤病灶邊緣>5 cm,男74例,女66例。該研究已獲倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)影像學(xué)(CT、X線)、病理學(xué)、肺穿刺等檢測確診為NSCLC〔7〕;(2)入組后成功施行手術(shù)治療成功,術(shù)前均未行抗腫瘤治療;(3)病例資料完整,依從研究方案,接受術(shù)后隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入組前接受過其他治療,放療、化療等;(2)既往肺部手術(shù)史,復(fù)發(fā)性肺癌;(3)存在其他原發(fā)性惡性腫瘤;(4)死于NSCLC以外的其他因素;(5)嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙;(6)缺乏隨訪資料。

1.2一般資料收集 收集受試者的臨床資料,包括性別、年齡、吸煙、TNM分期、癌癥類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存情況。電話隨訪獲取患者術(shù)后3年內(nèi)的生存情況,如是否死亡及死亡時間。

1.3采用免疫組化法檢測癌組織、癌旁組織cortactin表達(dá)水平 術(shù)中獲取癌組織、癌旁正常組織,甲醛溶液固定,石蠟包埋,連續(xù)切片(厚度4 μm),常規(guī)脫蠟,脫苯,水化,行抗cortactin免疫組織化學(xué)染色。焦碳酸二乙酯(DEPC)抗原進(jìn)行熱修復(fù),3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶。加入山羊血清,37 ℃孵育0.5 h,加入cortactin抗體(1∶500),4 ℃過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,加入山羊抗兔辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗,37 ℃孵育0.5 h,PBS沖洗3次,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色,蒸餾水漂洗、蘇木素復(fù)染,脫水、中性樹膠封片。每張切片中隨機(jī)選取10個400倍視野,采用Image-Pro Plus6.0軟件計cortactin的積分光密度(IOD),取平均值為最終結(jié)果,以PBS代替一抗作為陰性對照,計算組織中cortactin相對表達(dá)量(相對IOD值)。

1.4MVD 癌組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋,以CD34標(biāo)記腫瘤微血管,低倍鏡(×100)下觀察切片,尋找3個最強(qiáng)的新生血管形成區(qū)域,微血管計數(shù)取均值,其中具有較厚肌層的或者血管腔內(nèi)≥8個紅細(xì)胞的血管排除在外。

1.5隨訪 隨訪8～36個月,隨訪截至2021年9月30日,每3個月1次電話隨訪,詢問患者生存情況,若患者生存時間低于3年,記錄生存時間,并終止隨訪。入組146例患者中6例失訪。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、獨立樣本t檢驗、Pearson相關(guān)性分析,術(shù)后生存率采用Kaplan-Meier曲線表示,采用COX比例風(fēng)險模型分析NSCLC術(shù)后預(yù)后的影響因素。

2 結(jié) 果

2.1cortactin在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況 癌組織cortactin表達(dá)量(1.09±0.27)明顯高于癌旁組織(0.65±0.12;t=17.118,P<0.001),見圖1。

圖1 cortactin在癌旁組織及癌組織中陽性表達(dá)(免疫組化,×400)

2.2癌組織中cortactin表達(dá)量與MVD計數(shù)的關(guān)系 癌組織中MVD計數(shù)為(38.09±7.27)個,Pearson相關(guān)性分析顯示MVD與cortactin呈正相關(guān)(r=0.594,P<0.05)。

2.3影響預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年,140例 NSCLC患者中死亡58例(41.43%)。單因素研究結(jié)果顯示,臨床分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MVD、cortactin與NSCLC患者預(yù)后存在相關(guān)性(P<0.05),即死亡患者臨床分級多為Ⅲ級,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例及MVD計數(shù)、cortactin表達(dá)水平較高,見表1。

表1 影響NSCLC患者預(yù)后的單因素分析(n)

2.4癌組織cortactin表達(dá)量對預(yù)后的預(yù)測價值 以生存情況(存活=0,死亡=1)為因變量,對癌組織cortactin表達(dá)量預(yù)測患者預(yù)后價值進(jìn)行ROC分析結(jié)果顯示,cortactin截斷值為1.15時,診斷曲線下面積為0.844(95%CI:0.796～0.902),靈敏度為77.59%,特異度為86.59%,約登指數(shù)為0.594,見圖2。

圖2 cortactin預(yù)測NSCLC患者預(yù)后的ROC曲線

2.5采用COX比例風(fēng)險模型分析NSCLC術(shù)后預(yù)后的影響因素 以生存情況(存活=0,死亡=1)為因變量,以單因素分析中具有顯著差異的變量為自變量,采用COX比例風(fēng)險模型分析,各變量賦值為:臨床分級:Ⅰ級=0,Ⅱ級=1,Ⅲ級=2;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:否=0,是=1;MVD:測量值;cortactin:≤1.15=0;>1.15=1。結(jié)果顯示臨床分級(HR=1.962,95%CI:1.260～3.056)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=1.881,95%CI:1.057～3.348)、MVD(HR=2.309,95%CI:1.147～4.649)、cortactin(HR=2.477,95%CI:1.214～5.055)均是影響患者預(yù)后的獨立危險因素(均P<0.05)。

2.6cortactin表達(dá)量對總生存期情況的影響 截止末次隨訪時間,陰性組中位生存時間〔(30.56±2.68)個月,n=74〕明顯高于陽性組〔(27.15±2.30)個月,n=66;χ2=4.235,P=0.022〕,見圖3。

圖3 cortactin表達(dá)量對NSCLC患者3年生存情況的影響

3 討 論

NSCLC的發(fā)病率、死亡率均較高,其在病程早期便可通過淋巴結(jié)、血液循環(huán)等途徑發(fā)生轉(zhuǎn)移,研究認(rèn)為,轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致NSCLC患者死亡的主要原因〔8〕。cortactin是一種新的肌動蛋白結(jié)合蛋白,屬于細(xì)胞骨架重組的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)蛋白,可以與纖維狀肌動蛋白(F-actin)連接,調(diào)控細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附及腫瘤細(xì)胞侵襲,且研究已證實,其與惡性腫瘤患者的病理分期密切關(guān)聯(lián),影響腫瘤進(jìn)展〔9,10〕。既往研究表明,cortactin在多種惡性腫瘤中過量表達(dá),包括直腸癌、乳腺癌、結(jié)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤等,且cortactin的表達(dá)與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、遷移血管生成等方面密切相關(guān)〔11〕。Uzair等〔12〕研究認(rèn)為,cortactin參與腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與肌動蛋白相關(guān)蛋白(Arp)2/3復(fù)合體存在協(xié)同效應(yīng),誘導(dǎo)F-actin骨架的重構(gòu),從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。盡管有眾多的相關(guān)研究,但cortactin促進(jìn)的惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制尚未達(dá)成共識,且其在NSCLC中的表達(dá)情況及對預(yù)后的影響也尚不明確。

本研究結(jié)果表明,cortactin在NSCLC癌組織中處于高表達(dá)狀態(tài),參與調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展過程。腫瘤血管新生是腫瘤微環(huán)境的重要特征,與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān),新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常,血管基質(zhì)不完善,容易發(fā)生滲漏,故而腫瘤細(xì)胞可直接穿過血管內(nèi)進(jìn)入血流,并在遠(yuǎn)隔部位形成轉(zhuǎn)移,增加了腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險〔13～16〕。本研究結(jié)果表明,cortactin可能通過促腫瘤血管生成而誘導(dǎo)疾病進(jìn)展。分析認(rèn)為,cortactin在血管內(nèi)皮細(xì)胞中普遍表達(dá),調(diào)控細(xì)胞骨架重組及遷移,cortactin可能是惡性腫瘤血管形成過程中的關(guān)鍵因子之一〔17,18〕。

本研究結(jié)果表明,臨床分級Ⅲ級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、cortactin高表達(dá)、MVD高值均可增加術(shù)后不良預(yù)后風(fēng)險。李恒等〔19〕、Yamada等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),高的臨床分級(Ⅲ～Ⅳ)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者癌組織中cortactin表達(dá)陽性率較高,惡性程度越高,臨床分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的結(jié)果,可增加術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險,故而是影響NSCLC患者術(shù)后預(yù)后的危險因素。增殖、侵襲可增加術(shù)后復(fù)發(fā)、死亡風(fēng)險,以上這些參數(shù)直接反映NSCLC的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移情況,可推測cortactin高表達(dá)的患者腫瘤惡性程度較高,預(yù)后較差,需重點關(guān)注cortactin高表患者,術(shù)后定期復(fù)查。

本研究結(jié)果表明,cortactin水平與NSCLC患者的遠(yuǎn)期預(yù)后密切關(guān)聯(lián),即cortactin表達(dá)量越高則死亡風(fēng)險越高。cortactin是位于染色體11q13的多結(jié)構(gòu)域蛋白,通過與肌動蛋白相關(guān)蛋白Arp2/3復(fù)合物結(jié)合,誘導(dǎo)肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)分支的形成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞形成片狀偽足,進(jìn)而增加了腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移等能力〔10,21,22〕。研究〔10,23,24〕證實,cortactin在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中過度表達(dá),且表達(dá)水平與組織學(xué)分級惡性程度增高、遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期縮短、局部復(fù)發(fā)率增加及5年總生存率下降相關(guān),結(jié)合本次結(jié)果進(jìn)一步證實cortactin高表達(dá)患者惡性程度高,不良預(yù)后風(fēng)險高。研究表明,磷酸化黏著斑激酶可以通過PRR2和PRR2區(qū)域而與cortactin直接相連,進(jìn)而使黏著斑重塑,同時cortactin還能分泌金屬蛋白激酶,降解局部基質(zhì)蛋白,提高了腫瘤細(xì)胞的移動能力〔25〕。黏著斑激酶(FAK)-Src復(fù)合體可以導(dǎo)致cortactin蛋白磷酸化,研究證實cortactin磷酸化程度與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞潛力能力呈正相關(guān)性〔26,27〕。另外,龍謙等〔28〕通過體外細(xì)胞實驗證實,采用小干擾RNA技術(shù)抑制肺癌A549細(xì)胞表達(dá)cortactin,其的侵襲、遷移能力明顯降低,cortactin表達(dá)與肺癌患者生存預(yù)后有關(guān),有望成為肺癌治療的新靶點。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明,cortactin具有良好的預(yù)測價值,可作為NSCLC預(yù)后的標(biāo)志物。

綜上,NSCLC癌組織中cortactin高表達(dá),且與MVD存在正相關(guān)性,是影響NSCLC患者術(shù)后預(yù)后的危險因素,對于預(yù)后具有良好的診斷效能。