老年癡呆患者外周血單個核細胞miRNA-16和miRNA-192表達及與認知功能的關系

鄭昌江 鄒德宇

(麗水市第二人民醫院精神科,浙江 麗水 323000)

癡呆是常見的一種造成老年人認知功能障礙疾病。據統計表明,隨著老齡化加劇,其患病率呈不斷上升趨勢〔1,2〕。藥物治療癡呆雖可改善臨床癥狀,生存時間延長,但常需終身服藥,患者患有溝通障礙且依從性差,常不配合治療〔3,4〕。因此,采取及時有效的診治癡呆方法及評估患者認知功能尤為重要。微小RNA(miRNA)是具有功能性、內源性的一種非編碼RNA,其表達參與正常生理過程的調控,還與腫瘤、神經系統、精神系統疾病發生發展等關系緊密〔5〕。近年來,miRNA-16和miRNA-192與精神疾病方面具有關系。本研究旨在探討老年癡呆患者外周血單個核細胞miRNA-16和miRNA-192表達及與認知功能的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇麗水市第二人民醫院于2020年1月至2022年6月老年癡呆患者64例,其中男37例,女27例;年齡61～78歲,平均(70.42±4.15)歲;病程1～15年,平均(7.87±1.49)年;根據患者認知功能障礙情況分為輕度組(n=29)與中度組(n=35)。另選擇同期老年健康體檢者60例為對照組,其中男36例,女24例;年齡60～76歲,平均(68.98±4.62)歲。各組性別、年齡無統計學差異(P>0.05)。納入標準:(1)符合第3版中國精神障礙分類與癡呆診斷標準;(2)年齡≥60歲;(3)患者軀體功能正常;(4)獲得知情同意。排除標準:(1)合并惡性腫瘤;(2)視聽功能不全;(3)合并腦外傷、腦卒中等其他中樞神經系統疾病;(4)存在溝通交流障礙者;(5)心、肺、肝腎功能不全。

1.2主要試劑與儀器 主要試劑:Ficoll淋巴細胞分離液(美國Sigma公司),TRIzol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司),反轉錄試劑盒(大連寶生物工程公司),實時定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(日本Takara公司)。主要儀器:7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3miRNA-16和miRNA-192表達測定 采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法測定miRNA-16和miRNA-192表達,采集所有受試者清晨空腹肘靜脈血3 ml,依據Ficoll淋巴細胞分離液說明書提取外周血單個核細胞,根據TRIzol試劑說明書提取外周血單個核細胞總RNA,經DEPC水溶解后,總RNA濃度和純度采用NanoDrop分光光度儀測定。采用反轉錄試劑盒進行逆轉錄反應;采用SYBR Premix Ex TaqTM進行熒光定量PCR,測定LncRNA MALAT1表達。總反應體系20 μl:SYBER GREEN 6.8 μl、PCR上游引物 0.4 μl、染料(DYE) 0.4 μl、PCR下游引物0.4 μl、cDNA 2.0 μl、RNase-free H2O 10 μl,混勻,置于實時熒光定量PCR儀擴增。反應條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,40個循環。內參選擇GAPDH。采用2-△△Ct法分析結果,△Ct=Ct目的基因-CTU6;△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。由上海生工生物工程有限公司合成引物。miRNA-16上游引物:5′-TAGCAGCACGTAAATATTGGGG-3′,下游:5′-TCAA-CGATACGCTACGTAACGAAAA-3′;miRNA-192上游引物:5′-CTGACCTATGAATTG-3′,下游:5′-GACCTATGAATT-3′。GAPDH上游引物:5′-GAGTCA-ACGGATTTGGTCGT-3′,下游:5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。

1.4認知功能評價 采用簡易精神狀態檢查(MMSE)量表評估,評分0～30分,評分越高認知功能越好,MMSE評分≥27分表示認知功能正常,<27分表示認知功能障礙。以MMSE評分21～26分為輕度認知功能障礙,10～20分為中度認知功能障礙,0～9分為重度認知功能障礙。

1.5統計學處理 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、Pearson分析及受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結 果

2.1各組miRNA-16和miRNA-192表達比較 癡呆組miRNA-16(1.85±0.34)和miRNA-192相對表達量(2.64±0.47)高于對照組(1.00±0.02、1.01±0.02),差異顯著(t=19.329、26.834,均P<0.05)。中度組miRNA-16(2.20±0.41)和miRNA-192相對表達量(3.40±0.58)高于輕度組(1.43±0.28、1.72±0.37),差異顯著(t=8.585、13.481,均P<0.05)。

2.2兩組MMSE評分比較 癡呆組MMSE評分〔(20.78±3.41)分〕低于對照組〔(27.98±0.62)分〕,差異顯著(t=16.104,P<0.05)。

2.3miRNA-16和miRNA-192表達與MMSE評分相關性 miRNA-16和miRNA-192表達與MMSE評分呈線性負相關(r=-0.674、-0.586,均P<0.05)。

2.4miRNA-16和miRNA-192對認知功能預測價值 miRNA-16對認知功能預測靈敏度為85.90%,特異度為96.70%,ROC曲線下面積(AUC)為0.954(95%CI0.915～0.992),P=0.000;miRNA-192對認知功能預測靈敏度為85.90%,特異度為98.30%,AUC(95%CI)為0.944(0.904～0.984),P=0.000,見圖1。

圖1 ROC曲線分析miRNA-16和miRNA-192對認知功能預測價值

3 討 論

癡呆是由遺傳、環境等因素引起的一種常見神經內科疾病,具有病程長、逐步進展等特點,易不可逆損傷患者生活質量和社會功能,降低患者日常生活能力,且隨著病情發展將逐漸減退患者生活質量〔6～8〕。癡呆患者會表現出不同程度認知功能障礙,而認知功能損害多與炎性損傷、神經變性及神經內分泌有關〔9～11〕。

miRNA在真核生物體中廣泛存在,參與細胞增殖、分化、凋亡等過程,且與多種疾病的發生、發展及個體生長發育、機體代謝密切相關〔12〕。多種miRNA的表達在缺血缺氧的生物體內能夠發現異常表達〔13,14〕。在大腦缺血再灌注后,缺血區及其周圍區的趨化因子、免疫分子、細胞黏附分子、細胞因子及應激蛋白等出現不同變化,且低氧會導致miRNA的異常表達〔15〕。在神經系統發育、成熟及學習記憶等生理功能過程中,突觸的可塑性具有重要作用,且認為是構成學習記憶功能的基礎。研究發現,miRNA可通過對調控突觸可塑性的相關蛋白,以此影響突觸的可塑性〔16〕。此外,miRNA也能夠通過對樹突棘形態調節而調控突觸的可塑性。在癡呆、腦卒中及其他腦血管疾病中存在miRNA表達異常〔17〕。有研究證實,miRNA在腦血管疾病中對基因調控過程具有改善作用。在中樞神經系統損傷后miRNAs會出現異常表達,不僅能夠刺激炎癥、神經元死亡的發生,且還能夠促進氧化應激及細胞凋亡〔18〕。故而認為,miRNAs能夠作為繼發性腦損傷的敏感性生物標志物,可作為癡呆的生物標志物。通過識別生物標志物有利于更好地理解癡呆的致病機制和病因,且可通過發現新的miRNA可能有利于改善癡呆的早期診斷及其發展。目前,關于miRNA-16和miRNA-192與癡呆及認知功能方面研究甚少,缺乏可靠的臨床參考依據。本研究表明,miRNA-16和miRNA-192與認知功能明顯相關;且對認知功能具有良好預測價值。