miR-375-3p過表達調控Akt-eNOS信號通路促進心肌梗死大鼠心肌修復作用機制

熊浩倫 樓定進 王央

(義烏市中心醫院,浙江 義烏 322000)

心肌梗死(MI)是當冠狀動脈發生病變時,導致冠狀供血突然減少、中斷,讓心肌長時間處于急性缺血的狀態,最終引發心肌出現缺血性的壞死〔1,2〕。當MI發生后,心肌細胞喪失再生能力,不能修復壞死的心肌細胞。目前臨床上常采用藥物、手術介入等治療手段,雖然其治療方法一直推陳出新,但仍有大部分患者由于過度心室重構而發展為心力衰竭,嚴重影響預后〔3〕。因此,有效改善MI患者的心肌修復從而降低患者死亡率和致殘率是臨床面臨的難題。微小RNA(miRNA)是非編碼小分子RNA中的一種,通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(UTR)互補配對結合而抑制靶mRNA的翻譯或促進靶mRNA的降解從而降低目標蛋白的表達,進而發揮其生物學作用〔4,5〕。隨著對miRNAs研究的不斷深入,已證實miRNAs在心肌細胞分化和心臟發育過程中也發揮著極其重要的作用〔6〕。生物信息學研究發現,miR-375在進化上高度保守,經文獻檢索發現miR-375-3p的研究目前主要集中于肺發育和胰島功能等方面〔7〕,但其對心肌的研究尚無報道。此外,除了miRNAs,多條信號通路都和MI有關,其中其中挽救激酶通路途徑的磷酸肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)介導MI的發生發展,內皮型一氧化氮(NO)合酶(eNOS)是該途徑的一個下游靶點,也是產生信號分子NO的關鍵酶,PI3K/Akt-eNOS信號通路介導了缺血后處理減輕心肌缺血再灌注損傷的作用〔8,9〕。研究發現,Akt和eNOS可有效調控缺血組織的血管再生,對缺血組織血流動力學異常有明顯的改善作用〔10〕,但Akt-eNOS信號對MI調控還不十分明確。因此本研究制備MI大鼠模型,觀察過表達miR-375-3p通過調控Akt-eNOS通路對其心肌修復的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 40只雄性SD清潔級大鼠均購自遼寧省本溪實驗動物中心,合格證號:SCXK(遼)2013-0009。體質量(180±20)g,統一飼養在室溫25～26 ℃、相對濕度55%～70%的動物房內,光照12 h一循環為晝夜交替。本研究獲得遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準,實驗研究均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。

1.2試劑與儀器 miR-375-3p mimics慢病毒和mimics NC 空病毒(上海吉瑪基因有限公司,批號150292);Akt、pAkt、eNOS、p-eNOS多克隆抗體(Cell Signaling公司,批號分別為4691P、4060S、9572S、9571S);聚合酶鏈反應(PCR)引物序列(Invitrogen公司,批號RR037Q);血清肌鈣蛋白(cTnT)I檢測試劑盒(濰坊祺翔生物科技有限公司);乳酸脫氫酶(LDH,上海康朗生物科技有限公司);腦鈉肽前體(Pro-BNP,杭州普望生物技術有限公司);80-2臺式低溫離心機(Pro-BNP,上海醫療器械有限公司);4X41RF顯微鏡(OLYMPUS公司);SABA-18全自動生化分析儀(AMS公司)。

1.3雙熒光素酶報告基因 將長至80%融合度的HEK-293細胞,胰蛋白酶消化后以適當密度接種至6孔細胞培養板中,參照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書將構建好的Akt-3′-UTR-WT、Akt-3′-UTR-MUT、eNOS-3′-UTR-WT、eNOS-3′-UTR-MUT質粒轉染miR-NC(NC組),miR-375-3p mimics(miR-375-3p組)共轉染至細胞,按照雙試劑盒操作步驟檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.4分組和模型制備 按照數字表法,將40只大鼠隨機分為假手術(sham)組;MI模型(MI)組;陰性對照(NC)組給予mimics NC空病毒干預;miR-375-3p組給予miR-375-3p mimics慢病毒干預,每組各10只。常規復合麻醉劑腹腔注射麻醉后將大鼠固定于手術臺中,將心電圖電極連接于四肢皮下組織,術中記錄心電圖變化情況。于胸骨上窩正中處做一切口,向下端鈍性分離并將下頜下腺推開,將氣管顯露于手術視野中,環形氣管切開后插入自制氣管插管,深度1.0 cm,人工控制大鼠呼吸頻率。于胸骨左旁第3～4肋間做一切口,分離皮下組織和肌肉后撐開肋骨,暴露心臟,找到左冠狀動脈前降支起始部,使用6-0縫合線穿刺左冠狀動脈前降支,并與部分心肌共同結扎,完成后觀察左室壁是否出現運動減弱和室壁蒼白,觀察心電圖出現ST段明顯抬高證明模型制備完成。觀察15 min無異常后進行止血,縫合切口后行常規氣管插管,大鼠可自主呼吸后將插管移除,縫合切口,常規切口清洗消毒。sham組僅在左冠狀動脈前降支穿線,但不結扎。

1.5藥物干預 miR-375-3p組在大鼠心臟多點位注射10 μl miR-375-3p mimics慢病毒干預;NC組在大鼠心臟多點位注射10 μl mimics NC空病毒干預;sham組和MI組給予等量生理鹽水多點位注射心臟。所有大鼠連續注射7 d。

1.6RT-PCR檢測miR-375-3p表達 取各組大鼠心肌組織,無菌環境下研磨組織,將研磨液置于離心管中上機離心5 min,3 500 r/min。收集上清液于總RNA檢測試劑盒中,提取總RNA,紫外分光光度計檢測RNA濃度。引物序列:miR-375-3p上游引物:5′-CACATTTGTTCGTTCGGCTC-3′,下游:5′-ATCCA-GTGCGTGTCGTGGA-3′;β-actin上游引物:5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′,下游:5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。RT體系為10 μl,取2.0 μl模板(cDNA)進行擴增。PCR體系在95 ℃下變性5 min,循環條件為95 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共45個循環,最后延伸5 min。分離電泳產物并拍照。通過凝膠灰度分析儀對實驗條帶進行掃描得出條帶灰度值,每個實驗灰度取平均值。

1.7心功能檢測 治療1 w后以水合氯醛麻醉大鼠,備皮后右側臥位固定在小型動物手術臺上,利用小型動物專用彩色超聲影像系統檢測左心室收縮末期內徑(LVESD)、 左心室舒張末期內徑(LVEDD)、短軸縮短率(FS)、 左室射血分數 (LVEF)。4 個參數測定值均取3個連續心動周期平均值。

1.8血清心肌損傷標志物檢測 取各組大鼠尾靜脈血于離心管中,離心收集上清液,用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測血清中cTnTI、LDH、Pro-BNP水平。在500 μl樣本稀釋液中加入5 μl 血清樣本混勻,在各反應孔中加入稀釋的10 μl 血清樣本,然后將100 μl 酶試劑加入各反應孔中,25 ℃放置45 min,水洗、吸干后加入100 μl顯色劑,室溫孵育20 min,加入終止液,在450 nm處利用酶標儀檢測吸光度值,計算樣本濃度。

1.9MI面積測定 待大鼠完成心功能檢測后,麻醉大鼠后取出心臟,以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈,在心尖部穿棉繩,將心臟懸掛于-20 ℃冷凍20 min;取出心臟后在錫箔紙上橫切為3 mm的薄片,加入2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液37 ℃恒溫染色60 min,每10 min翻動1次;置于中性甲醛溶液中固定24 h,利用Image Pro plus60軟件分析心肌梗死面積。心肌梗死面積(%)=(梗死面積/左心室總面積)×100%。

1.10心肌組織病理學變化 麻醉各組大鼠,取出心臟,獲取左心室心肌組織,置于多聚甲醛中固定24 h,石蠟包埋組織,切成5 μm的薄片,蘇木素-伊紅(HE)染色組織薄片,封片后顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.11Western印跡檢測心肌組織Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達 取各組左室缺血區心肌組織200 mg,裂解,研磨組織制成勻漿,離心,收集上清液并測定總蛋白含量。取30 μg蛋白上樣煮沸、電泳、聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉印。封閉組織后加入一抗和二抗,充分混勻后孵育5 min,一抗稀釋液加入組織中,充分混勻后轉至PVDF膜上,成像、顯色,測定蛋白灰度值。

1.12統計學方法 采用SPSS13.0軟件,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1雙熒光素酶報告 構建載體后行雙熒光素酶報告基因實驗,結果顯示,轉染miR-375-3p后顯著增加Akt和eNOS活性(P<0.05),但對突變基因的影響不明顯(P>0.05)。表明Akt和eNOS可能是miR-375-3p的靶基因,見表1。

表1 雙熒光素酶報告

2.2各組心肌組織miR-375-3p表達比較 MI組、NC組心肌組織miR-375-3p表達顯著低于sham組(P<0.05),且MI組和NC組心肌組織miR-375-3p表達無顯著差異(P>0.05);miR-375-3p組心肌組織中miR-375-3p表達顯著高于sham組及MI組(P<0.05),見表2。

表2 各組心肌miR-375-3p表達、LVEDD 、LVESD、FS、LVEF及MI面積比較

2.3各組心功能指標比較 和sham組相比,MI組、NC組及miR-375-3p組LVEDD、LVESD顯著升高,FS、LVEF顯著降低(P<0.05),且MI組和NC組LVEDD、LVESD、FS、LVEF比較無顯著差異(P>0.05);和MI組相比,miR-375-3p組LVEDD、LVESD顯著降低,FS、LVEF顯著升高(P<0.05),見表2。

2.4各組MI面積比較 MI組、NC組及miR-375-3p組MI面積較sham組顯著增加(P<0.0.5),且MI組和NC組無顯著差異(P>0.05);miR-375-3p組MI面積明顯少于MI組(P<0.05),見表2、圖1。

圖1 各組心肌組織TTC染色

2.5各組心肌組織Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達比較 和sham組相比,MI組、NC組及miR-375-3p組Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達明顯降低(P<0.05);MI組和NC組Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白變化無顯著差異(P>0.05);和MI組相比,miR-375-3p組Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白均顯著增加(P<0.05),見圖2、表3。

圖2 Western印跡檢測各組心肌組織Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達

表3 各組心肌損傷標志物LDH、cTnTI、Pro-BNP及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達比較

2.6各組心肌損傷指標比較 和sham組相比,MI組、NC組及miR-375-3p組LDH、cTnTI、Pro-BNP均顯著增加(P<0.05),且MI組和NC組LDH、cTnTI、Pro-BNP表達無顯著差異(P>0.05);和MI組相比,miR-375-3p組LDH、cTnTI、Pro-BNP顯著降低(P<0.05),見表3。

2.7各組心肌組織病理學變化比較 和sham組相比,MI組心肌組織損傷嚴重,心肌細胞排列無規則,纖維組織腫脹嚴重,細胞核出現固縮且有大量細胞核碎裂,甚至出現溶解,心肌組織中有大量炎性細胞浸潤,大量壞死心肌細胞出現;NC組心肌組織和MI組無明顯差異。干預后miR-375-3p組心肌組織較MI組得到明顯改善,壞死的心肌細胞減少,炎性細胞浸潤也明顯減少,見圖3。

圖3 各組心肌組織病理學(HE染色,×200)

3 討 論

MI是心臟外科最常見的急癥之一,是指由于冠狀動脈阻塞引發持久而嚴重的心肌缺血所導致的部分心肌壞死,多出現心律失常、心力衰竭、發熱、急性循環功能障礙和血清心肌損傷標記酶的升高,可并發休克或心力衰竭〔11,12〕,是導致心衰的重要病因。長久以來認為,由于心肌細胞在出生后即進入終末分化退出細胞周期,心肌損傷導致的心肌細胞減少是不可逆的過程。然而,越來越多的研究證明哺乳動物的心臟處于一個細胞持續循環的狀態,具有再生潛力,這為MI后心衰的治療帶來的曙光〔13〕。近些年隨著對MI病理生理機制研究的深入及新技術、新藥的不斷出現,MI的住院病死率已經明顯下降。但是對大面積MI患者來說,即使及時給予積極的藥物及再灌注治療,但終因MI范圍較大,且部分患者錯過了最佳的治療時機而導致患者發生心力衰竭。miRNA可通過調控細胞增殖、分化、侵襲和轉移過程參與疾病的發生、發展過程,且部分miRNA還可以作為評估患者病情及預后的生物標志物〔14〕。有研究表明,miRNA參與急性MI缺血再灌注損傷,在缺血再灌注早期可以出現心肌表達miRNA的改變,miRNA有望成為減輕心肌缺血再灌注的治療靶點〔15〕。有報道證實,miR-375主要參與內分泌系統疾病、孕前及妊娠期肥胖等〔16〕。

本實驗制備MI大鼠模型并給予過表達miR-375-3p,其在大鼠體內表達增加說明慢病毒質粒轉染成功。MI是心血管疾病患者常見死亡原因。MI常發生血流動力學異常,心臟收縮、舒張功能降低、心肌耗氧量增加,其是評價MI好壞的關鍵指標〔13〕。本研究結果顯示,過表達miR-375-3p能改善MI大鼠心臟收縮、舒張功能,改善心室順應性。占天為等〔17〕發現,MI大鼠LVEDD 、LVESD升高、FS、LVEF降低,益氣活血方能夠提高MI大鼠心功能,與本實驗結果一致。臨床實踐證明,血清心肌酶水平可反映心肌細胞的損傷程度,包括LDH、肌酸激酶、cTnTI、Pro-BNP等,其中以cTnTI表達水平的敏感性和特異性最高,為目前較理想的MI標志物〔18〕。本研究結果說明,miR-375-3p能抑制受損心肌細胞釋放出的活性酶,修復受損心肌,與羅遠林等〔19〕研究結果相似。袁輝等〔20〕研究證實,模型成功后不同時間伴有血清酶譜LDH、肌酸磷酸激酶(CK)、cTnT表達水平升高,表明成功復制了大鼠MI模型。

Akt-eNOS是再灌注損傷補救酶信號轉導通路的組成之一,通過影響下游相關蛋白的表達,產生心臟保護作用,主要依賴于Akt的磷酸化,活化的Akt可通過下游多個效應器,如活化的Akt磷酸化eNOS誘導內源性NO生成〔21〕。該通路有多種效應分子,而Akt處于這一通路的中心環節,也是最主要的靶酶,只有磷酸化的Akt才具有抗凋亡、蛋白合成及促細胞生存等活性。MI發生時,組織中的eNOS表達被促進,介導血流的調節,對血管痙攣有很好的抑制作用,進而減少炎性細胞浸潤等灌注損傷。本研究結果顯示,Akt、eNOS及其磷酸化在MI大鼠中低表達,過表達miR-375-3p可促進Akt-eNOS信號通路的激活。miR-375-3p過表達可激活Akt-eNOS信號通路,增加效應蛋白Akt磷酸化,激活下游靶目標eNOS,從而發揮對MI的保護作用。邵玲等〔22〕研究證實,楊梅素對MI后心臟重構有很好改善作用,其機制與Akt信號通路被激活有關。He等〔23〕研究證實,miR-375通過下調蛋白激酶D(PDK)1的表達、抑制Akt的激活及影響焦激酪酸激酶(FAK)的絡氨酸磷酸化,進而抑制細胞遷移。