大黃素調控P53/P21通路對H2O2誘導損傷HUVEC的保護作用

宋紫薇 吳銘杰 李育 趙鳳鳴 霍介格 李文婷

(南京中醫藥大學,江蘇 南京 210023)

全世界每年死于心腦血管疾病的人數高達1 500萬人〔1〕。目前對心腦血管疾病的治療,包括藥物治療、介入治療、外科治療等,其中藥物治療是基礎,是最為重要和首選的方法,而中醫藥防治心腦血管疾病具有顯著的特色和優勢。大黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤〔2～4〕等多種藥理作用。劉廣等〔5〕發現大黃素可能通過抗氧化應激及抑制凋亡等途徑對硫酸吲哚酚誘導的心肌損傷有一定的保護作用;孫攀興等〔6〕發現大黃素通過調控Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB通路、抑制炎癥對脂多糖(LPS)誘導的血管內皮細胞(HUVEC)細胞氧化損傷具有顯著保護作用;劉鳴昊等〔7〕發現大黃素能通過調控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/NF-κB信號傳導通路,減輕肝臟炎癥,治療非酒精性脂肪性肝炎。涼血通瘀方為國醫大師周仲瑛教授臨床治療出血性腦卒中(腦出血)的經驗方,課題組前期研究發現,該方對患者腦內血腫和腦水腫治療效果顯著、并保護HUVEC〔8〕、改善凝血和炎癥相關因子〔9〕及抑制腦組織NF-κB p65蛋白的表達〔10〕等作用。該方以大黃為君藥,而大黃素是大黃的主要活性成分。本研究探討大黃素對過氧化氫(H2O2)誘導損傷的HUAEC的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 大黃素標準品購自中國藥品生物制品檢定所;人臍靜脈HUVEC株(上海細胞所);胰蛋白酶、DMEM高糖培養基(Gibco公司);胎牛血清(四季青);苯甲基磺酰氟(PMSF)、十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠試劑盒、RIPA蛋白裂解液(碧云天);二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、二抗(上海生工);一抗(Santa cruz);電化學發光(ECL)液(Bio-Rad);超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(建成生物)等。

1.2藥物制備 大黃素配制:二甲亞砜(DMSO,≤1 ml)溶解大黃素,單培定容至10 ml,配成800 μmol/L的母液,置于-20 ℃冰箱保存備用。細胞培養:將DMEM培養液(含10%胎牛血清)加入HUVEC中,置于37 ℃二氧化碳培養箱中培養1～2 d;取出,胰蛋白酶(0.25%)消化2～3 min,每周傳代培養2～3次。

1.3細胞增殖(MTT)實驗 取處于指數生長期的細胞,胰蛋白酶消化2 min左右,用DMEM培養液配成1×105/ml細胞懸液,加入96孔板;實驗分成正常組、模型組、DMSO對照組、2.5、5.0、7.5、15.0 μmol/L大黃素組;其中正常組加細胞懸液160 μl+生理鹽水40 μl,模型組加細胞懸液160 μl+生理鹽水20 μl+H2O220 μl,DMSO對照組加細胞懸液160 μl+生理鹽水20 μl+0.5%DMSO 20 μl,2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L和15 μmol/L大黃素組加細胞懸液160 μl+大黃素藥液20 μl+H2O220 μl;37 ℃二氧化碳培養箱孵育24 h,每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl,置于37 ℃培養箱繼續溫育4 h,吸棄上清液,加入150 μl DMSO,酶標儀490 nm波長測定OD值,計算細胞增殖率。

1.4倒置顯微鏡觀察細胞形態 倒置相差顯微鏡觀察HUVEC傳代貼壁后細胞的形態及生長狀況。

1.5Hoechst染色觀察細胞凋亡 預先放置有蓋玻片的6孔板中加入處于對數生長期的細胞懸液,細胞爬片后加入大黃素藥液,熒光顯微鏡觀察細胞結構變化。

1.6透射電鏡觀察細胞形態 胰蛋白酶消化細胞,DMEM培養液配成細胞懸液移入小細胞瓶培養24 h,加藥后于37 ℃培養箱繼續培養24 h,胰酶消化、離心后棄上清收集細胞,戊二醛、四氧化鋨前、后固定,經脫水、包埋、切片、乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染后,透射電鏡觀察細胞形態。

1.7SOD、MDA、NO和NOS的測定 具體操作參照試劑盒說明書。

1.8Western印跡檢測蛋白表達 將HUVEC接種至6孔培養板中(每孔細胞數為4×104個),待80%長滿后,吸棄原培養液,模型組和藥物組分別加入含H2O2和大黃素的培養液,37 ℃培養箱24 h后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次,加入裂解液4 ℃裂解2 h;12 000 r/min離心收集上清后BCA法蛋白定量調整蛋白濃度;適量蛋白樣品變性處理;10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE,濃縮膠40 V,分離膠80 V),后電轉移(120 mA,1 h)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;5%的脫脂奶粉封閉 1 h,PBST洗3次,加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜;PBST洗3次,加入二抗(1∶1 000),室溫下搖蕩孵育1 h,PBST 洗3次;電化學發光(ECL)法檢測蛋白。

1.9統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗,蛋白表達采用Image Lab5.2.1軟件分析。

2 結 果

2.1H2O2濃度篩選 H2O2濃度越大,對細胞增殖的抑制作用越明顯;兩者呈現明顯的量效關系,其中終濃度為100 μmol/L的H2O2能顯著抑制HUVEC細胞增殖,鑒于此本實驗以100 μmol/L的H2O2作為模型組劑量。

2.2大黃素有效作用劑量篩選 隨著大黃素劑量的增加,其促進細胞增殖的作用不斷減弱,當大黃素劑量>20 μmol/L時,對HUVEC細胞增殖顯示有抑制作用,因此本實驗選擇大黃素15.0、7.5、5.0、2.5 μmol/L 4個劑量(終濃度)進行后續實驗。

2.3大黃素對HUVEC細胞增殖的影響 與模型組相比,不同劑量大黃素組均能提高HUVEC細胞增殖,其中5.0 μmol/L大黃素效果最顯著。見表1。

表1 大黃素對細胞增殖的影響

2.4大黃素對HUVEC細胞形態和結構的影響 倒置顯微鏡觀察結果顯示:與對照組相比,模型組細胞數量明顯減少,細胞大分布不均勻,排列稀疏、紊亂,邊緣不清晰;與模型組相比,5.0 μmol/L大黃素組細胞數量明顯增加,排列緊密,大多保持多邊形,形態、結構同對照組接近。Hoechst實驗結果顯示:對照組HUVEC無凋亡現象,模型組細胞核有明顯的核固縮,細胞凋亡增加;5.0 μmol/L大黃素組細胞裂解、染色質固縮的現象有所改善,細胞凋亡明顯減少。電鏡結果顯示:模型組細胞質突起減少,胞質內可見一定量的空泡,細胞器有融合現象;而5.0 μmol/L大黃素組細胞核膜完整,細胞核及核仁明顯,空泡減少,胞質內有豐富的細胞器,基本恢復細胞正常形態。見圖1。

2.5大黃素對HUVEC細胞SOD、MDA、NO、NOS水平的影響 模型組SOD、NO、NOS明顯低于對照組,MDA水平明顯高于對照組(P<0.05);與模型組比較,大黃素各劑量組SOD活力、NO、NOS均顯著升高,7.5 μmol/L大黃素組、15.0 μmol/L大黃素組MDA明顯降低(P<0.05),見表2。

表2 各組SOD、MDA、NO、NOS水平比較

2.6大黃素對HUVEC細胞P53、caspase-3、P21蛋白表達的影響 模型組細胞P53、caspase-3和P21蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05),與模型組比較,5.0 μmol/L大黃素組P53、caspase-3和P21蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組細胞P53、caspase-3和P21蛋白表達

表3 大黃素對P53、caspase-3和P21蛋白表達的影響

3 討 論

HUVEC結構和功能的改變是多種心血管疾病的共同病理基礎〔11,12〕,氧化應激是HUVEC損傷及血管內皮功能紊亂的主要誘因,參與內皮細胞病理變化的各個環節,因此預防HUVEC損傷成為防治心腦血管疾病的重要途徑。H2O2是目前常用的氧化應激病理模型,它是體內氧化代謝的中間產物,是一種危害很大的氧自由基,可以穿透細胞膜到達細胞內,當積累到一定程度時就會造成HUVEC損傷〔13〕。本研究結果表明,H2O2通過氧化應激損傷HUVEC的形態和結構;造成細胞抗氧化功能下降,導致抗氧化酶SOD活力降低,脂質過氧化產物MDA生成增多;HUVEC分泌內源性舒張因子NO能力下降。經不同劑量大黃素干預后,SOD酶活力和NO、NOS的水平較模型組顯著提升,脂質過氧化產物 MDA的生成顯著減少,從而保護HUVEC免受損傷,維持其正常形態結構和功能。

P53蛋白與細胞周期的調控、細胞凋亡、細胞分化、DNA修復等重要的生物學功能有關,是細胞生長周期中的負調節因子;P21和P53共同構成細胞周期G1檢查站,是p53最重要的下游基因之一,當細胞受到損傷后,p53作用于p21基因,使其迅速表達,促使細胞凋亡;caspase-3是細胞凋亡的直接執行者,決定了細胞凋亡形態、生物化學改變,caspase-3基因高表達,被認為是啟動凋亡和凋亡的一個重要標志。本研究結果表明,H2O2通過激活細胞內P53,進一步活化P21和caspase-3,從而抑制HUVEC增殖并促使其凋亡,導致HUVEC損傷;經大黃素藥物干預后,P53/P21/caspase-3蛋白表達較模型組顯著降低,從而促進HUVEC增殖,抑制其凋亡。