circRBM33對鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制

曾偉 馬民 李燕偉 蘆二永

(1河南科技大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科,河南 洛陽 471003;2洛陽市中心醫院眼科)

鼻咽癌是起源于鼻咽上皮的頭頸部惡性腫瘤,國際癌癥統計數據顯示,2018年全球鼻咽癌新增病例高達129 079例〔1〕。東南亞和中國廣東是鼻咽癌高發地區,雖然磁共振成像、調強放療及同步放化療已被廣泛應用,但仍有30%患者最終出現復發和(或)遠處轉移,預后較差〔2〕。因此,闡明鼻咽癌轉移的分子機制,有望為鼻咽癌治療提供有效靶點。環狀RNA(circRNA)是在哺乳動物細胞中普遍存在的具有共價閉合連續環結構的單鏈RNA,其通過直接與微小RNA(miRNA)結合間接調節miRNA靶基因的表達,參與調控癌細胞的惡性表型〔3,4〕。研究發現,circRNA結合基序蛋白(circRBM)33在胃癌組織標本、細胞株中顯著上調,且CircRBM33的表達與胃癌的臨床特征密切相關,沉默circRBM33可誘導胃癌細胞凋亡,抑制細胞增殖、遷移和侵襲〔5〕。然而,鼻咽癌中circRBM33的表達模式和功能仍有待闡明。miR-3196是胰腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的抑制因子,miR-3196高表達能夠阻礙癌細胞的生長和轉移〔6,7〕。miR-3196被預測為circRBM33的靶點,但circRBM33是否通過靶向miR-3196影響鼻咽癌進展尚不明確。本研究通過檢測鼻咽癌組織中circRBM33、miR-3196表達水平,分析circRBM33、miR-3196的相互作用,揭示circRBM33靶向miR-3196對鼻咽癌細胞惡性表型的影響。

1 材料與方法

1.1組織來源 收集2019年3月至2020年3月河南科技大學第一附屬醫院進行內鏡下活檢術并確診的鼻咽癌患者33例(女12例,男21例,年齡31～71歲,中位年齡47歲)的癌組織和配對正常癌旁組織,所有組織切除后立即放入液氮中冷凍,并保存在-80 ℃冰箱。患者均診斷為非轉移性鼻咽癌,術前未接受任何抗腫瘤治療。本研究獲得患者書面知情同意,并經醫院倫理審查委員會審批。

1.2細胞和試劑 人鼻咽癌細胞6-10B購自美國菌種保藏中心;將circRBM33小干擾RNA(si-circRBM33)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、miR-3196模擬物(miR-3196 mimics)、miRNA模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-3196抑制物(miR-3196 inhibitor,anti-miR-3196)、miRNA抑制物陰性對照(anti-miR-NC組)、circRBM33過表達質粒(pcDNA-circRBM33)、空載質粒(pcDNA)、熒光素酶報告質粒購自廣州銳博生物公司;miRNA逆轉錄試劑盒購自美國ABI;細胞計數試劑盒(CCK-8)購自上海博谷生物公司;PrimeScript逆轉錄酶試劑盒、SYBR-Green Master Mix購自日本TaKaRa;包被基質膠的Transwell小室購自美國Millipore公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒、電化學發光(ECL)檢測試劑盒、鼠源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、鼠源上皮表型E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)單克隆抗體、兔源神經鈣黏素(N-cadherin)多克隆抗體、羊抗鼠或羊抗兔IgG二抗購自北京百奧萊博生物公司。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測circRBM33、miR-3196 mRNA相對水平 使用Trizol試劑臨床組織樣本中提取總RNA,分別利用miRNA逆轉錄試劑盒、PrimeScript逆轉錄酶試劑盒合成miR-3196、circRBM33的互補DNA(cDNA),再用SYBR-Green Master Mix進行RT-qPCR。用2-ΔΔCt方法分析circRBM33和miR-3196的相對水平。miR-3196上游引物5′-CCTGTGTATGCATCCTCGACTG-3′,下游5′-CTGGCGTGTAATGGAGTCG-3′;circR-BM33上游引物5′-CCCAGAAGAAGGACAGTATGAA-3′,下游5′-TGTAACACCCTGAGAACTGAAAT-3′;U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′;GAPDH上游引物序列5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′,下游5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′。

1.4細胞培養、實驗分組及處理 6-10B細胞培養在RPMI1640培養基中,待其80%匯合時,按1∶2比例傳代。將第三代對數期的6-10B細胞接種在24孔板上,每孔2×105個細胞,待其50%融合時,使用Lipofectamine2000將最終濃度為50 nmol/L的si-circRBM33、si-NC、miR-3196 mimics、miR-NC、si-circRBM33與anti-miR-NC、si-circRBM33與anti-miR-3196及終濃度為0.4 g/L的pcDNA、pcDNA-circRBM33分別轉染至6-10B細胞,分別記為si-circRBM33組、si-NC組、miR-3196組、miR-NC組、si-circRBM33+anti-miR-NC組、si-circRBM33+anti-miR-3196組、pcDNA組、pcDNA-circRBM33組。收集轉染48 h的6-10B細胞,RT-qPCR檢測轉染效果,進行后續實驗。另取未處理的6-10B細胞作為對照(Con)組。

1.5CCK-8法測定6-10B細胞活力 將轉染48 h的6-10B細胞(1×104個)接種于96孔板,48 h后加入CCK-8溶液,每孔10 μl。37 ℃孵育2.5 h。細胞活力以用酶標儀測得的各孔在450 nm波長處的光密度(OD)值表示。

1.6平板克隆實驗測定6-10B細胞克隆形成數 將6-10B細胞接種于6孔細胞板,每孔3×102個細胞,放入培養箱孵育10～14 d直到出現肉眼可見細胞集落。菌落固定,室溫下用0.5%結晶紫染色30 min。顯微鏡下進行計數(大于50個細胞的集落數量表示克隆形成數)。

1.7劃痕愈合實驗測定6-10B細胞遷移 將6-10B細胞接種在6孔細胞板,每孔1×106個細胞,細胞融合為一層時用100 μl移液槍頭尖端在細胞表面劃一直線。每孔用磷酸鹽緩沖液洗滌3次,200倍顯微鏡下測量劃痕距離0 h。37 ℃培養箱孵育24 h后,顯微鏡下測量劃痕距離24 h。劃痕愈合率=(劃痕距離0 h-劃痕距離24 h)/劃痕距離0 h×100%。

1.8Transwell實驗測定6-10B細胞侵襲 取100 μl細胞懸液(無血清培養基稀釋)、500 μl含血清培養基分別加入預先包被基質膠的Transwell小室上腔、24孔板下腔。37 ℃孵育24 h后,無菌棉簽除去未過膜細胞,用4%多聚甲醛和0.5%結晶紫分別固定和染色穿膜細胞。顯微鏡下進行細胞計數(隨機選擇5個視野),其均值作為細胞侵襲數量。

1.9Western印跡測定6-10B細胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達 用RIPA緩沖液提取各組6-10B細胞蛋白,隨后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,將得到的蛋白濕轉到聚偏氟乙烯膜上,然后按照封閉、孵育一抗(GAPDH抗體為1∶10 000稀釋,E-cadherin抗體為1∶500稀釋,N-cadherin抗體為1∶800稀釋)、孵育酶標二抗、化學發光顯色步驟進行。凝膠成像儀進行成像,并分析E-cadherin和N-cadherin蛋白相對表達水平。

1.10雙熒光素酶報告實驗 根據StarBase數據庫預測結果合成含有miR-3196結合位點序列的circRBM33野生型(WT)熒光素酶報告載體wt-circRBM33、突變型(MUT)熒光素酶報告載體MUT-circRBM33。分別將上述報告基因載體分別與miR-NC、miR-3196 mimics共轉染至6-10B細胞。轉染48 h后,將細胞裂解,并用熒光素酶檢測試劑盒檢測,熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性。

1.11統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1鼻咽癌組織circRBM33和miR-3196表達 與癌旁組織(1.00±0.06)相比,鼻咽癌組織中circRBM33相對表達(4.29±0.35)明顯升高(t=53.223、P=0.000),鼻咽癌組織中miR-3196相對(0.35±0.03)較癌旁組織(1.00±0.09))明顯下降(t=39.359、P=0.000)。

2.2干擾circRBM33表達對鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移和侵襲的影響 si-circRBM33組6-10B細胞中circRBM33相對表達較Con組、si-NC組顯著降低(P<0.05),提示轉染si-circRBM33后6-10B細胞中circRBM33表達受到抑制。si-circRBM33組與si-NC組、Con組比較,6-10B細胞OD值明顯下降,克隆形成數和細胞侵襲數量明顯減少,劃痕愈合率與N-cadherin蛋白表達明顯下降,E-cadherin蛋白表達明顯增高(P<0.05)。見圖1、圖2、圖3、表1。

表1 干擾circRBM33表達對鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖1 干擾circRBM33表達對鼻咽癌6-10B細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

圖2 干擾circRBM33表達對鼻咽癌6-10B細胞克隆形成的影響(結晶紫染色)

圖3 干擾circRBM33表達對鼻咽癌6-10B細胞遷移(×40)、侵襲(結晶紫染色,×400)的影響

2.3過表達miR-3196影響鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移和侵襲 miR-3196組6-10B細胞中miR-3196相對表達較Con組、miR-NC組顯著增加(P<0.05),提示轉染miR-3196 mimics后6-10B細胞中circRBM33表達上調。與Con組、miR-NC組比較,miR-3196組6-10B細胞OD值明顯下降,克隆形成數和細胞侵襲數量明顯減少,劃痕愈合率與N-cadherin蛋白表達明顯下降,E-cadherin蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖4、圖5、圖6、表2。

表2 過表達miR-3196對鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移和侵襲的影響

1～5:Con組、miR-NC組、miR-3196組、si-circRBM33+anti-miR-NC組、si-circRBM33+anti-miR-3196組

圖5 各組6-10B細胞克隆形成(結晶紫染色)

圖6 各組6-10B細胞遷移(×40)和侵襲(結晶紫染色,×400)

2.4抑制miR-3196表達逆轉了干擾circRBM33表達對鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移和侵襲的作用 si-circRBM33+anti-miR-3196組與si-circRBM33+anti-miR-NC組相比,6-10B細胞中miR-3196的相對表達明顯下降,細胞OD值、克隆形成數和細胞侵襲數、劃痕愈合率、N-cadherin蛋白表達明顯升高,E-cadherin蛋白表達顯著減少(P<0.05)。見圖4、圖5、圖6、表3。

表3 抑制miR-3196表達恢復了干擾circRBM33對鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移和侵襲的作用

2.5circRBM33靶向miR-3196 StarBase預測顯示miR-3196與circRBM33存在互補的核苷酸位點。見圖7。雙熒光素酶報告實驗結果顯示,同與WT-circRBM33共轉染,與轉染miR-NC組(1.02±0.07)比較,轉染miR-3196 mimics細胞相對熒光素酶活性(0.42±0.04)顯著降低(t=22.326、P=0.000)。pcDNA-circRBM33組6-10B細胞中miR-3196相對表達(0.35±0.03)顯著低于pcDNA組(1.00±0.00;t=65.000、P<0.05);si-circRBM33組6-10B細胞中miR-3196相對表達(2.29±0.27)明顯高于si-NC組(1.02±0.05;t=13.875、P<0.05)。

圖7 circRBM33與miR-3196互補的核苷酸序列

3 討 論

既往研究顯示,circRNA通過調節鼻咽癌細胞惡性行為在鼻咽癌發病、進展中具有重要作用,Hong等〔8〕研究發現,circRNA富含半胱氨酸型運動神經元蛋白(circCRIM)1通過競爭性結合與miR-422a結合,阻止miR-422a對其靶基因叉頭框蛋白(FOX)Q1的抑制作用,最終導致鼻咽癌轉移、上皮間質轉化(EMT)和多西紫杉醇耐藥,circCRIM1高表達提示鼻咽癌患者預后不良。Ke等〔9〕指出,沉默circRNA同源結構域相互作用蛋白激酶(circHIPK)3可降低鼻咽癌細胞在體內外的生長和轉移能力。因此,闡明circRNA在鼻咽癌中的作用可為鼻咽癌治療提供潛在有效靶點。本研究結果表明,circRBM33在鼻咽癌組織中上調表達,干擾circRBM33表達能夠抑制6-10B細胞的遷移、侵襲和增殖能力。EMT是腫瘤進展、轉移的重要步驟,多項研究發現,腫瘤細胞間充質細胞表型的獲得和細胞侵襲能力的增強關系密切〔10,11〕。此外,Ding等〔12〕研究發現,宮頸癌中circRBM33表達亦上調,敲除circRBM33明顯抑制宮頸癌細胞增殖和轉移,這與本研究中干擾circRBM33的抑制功能一致。

目前關于circRNA作用機制報道最為廣泛的是和miRNA的相互作用。Chen等〔13〕研究發現,放療抵抗鼻咽癌組織中circ_000543表達顯著高于放射敏感鼻咽癌組織,敲減circ_000543通過靶向上調miR-9可提高鼻咽癌細胞的放射敏感性。Li等〔14〕指出,miR-508-5p介導下調circ_0081534對鼻咽癌細胞增殖和侵襲的抑制作用。據報道,肝癌組織中miR-3196表達下調,且miR-3196下調與腫瘤大小、臨床病理分期相關,過表達miR-3196可抑制肝癌細胞生長,增加細胞凋亡〔15〕。miR-3196還可作為長鏈非編碼RNA(lncRNA)的下游靶基因參與調控乳腺癌細胞增殖、糖酵解、凋亡、遷移和EMT過程〔16,17〕。本研究發現,鼻咽癌組織中miR-3196表達下調,過表達miR-3196可降低6-10B細胞遷移、侵襲和增殖能力,下調蛋白N-cadherin表達,上調蛋白E-cadherin表達,這與miR-3196在乳腺癌中抗癌作用吻合〔17〕。進一步研究表明,miR-3196是circRBM33的直接靶點,且circRBM33對miR-3196具有負性調控作用。由于干擾circRBM33表達與過表達miR-3196對6-10B的抗癌作用一致,提示6-10B細胞中可能存在circRBM33/miR-3196調控途徑。本研究結果顯示,抑制miR-3196表達顯著逆轉干擾circRBM33對6-10B細胞增殖、遷移和侵襲的影響,進一步證實circRBM33靶向miR-3196調控6-10B細胞惡性生物學行為。

綜上,鼻咽癌組織中circRBM33表達上調,miR-3196表達下調。干擾circRBM33可抑制鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移和侵襲,其通過上調miR-3196表達實現。