不同劑量頭孢曲松對蛛網膜下腔出血大鼠腦水腫及GLT-1蛋白表達的影響和意義

劉俊杰 龔澤華 朱俊杰 劉少鵬 徐繼偉 李建民 趙雅寧

(華北理工大學 1臨床醫學院,河北 唐山 063000;2附屬醫院神經外科)

蛛網膜下腔出血(SAH)發病率和死亡率很高,占世界總死亡率的5%～7%,SAH幸存患者也常伴有持久神經功能缺損〔1〕。通常在SAH后的72 h內發生的早期腦損傷(EBI)是造成患者預后不良的重要原因〔2〕。腦水腫是EBI階段的主要病理損傷機制〔3〕。作為中樞神經系統主要興奮性遞質的谷氨酸鹽,在SAH后EBI的病理損傷過程中發揮重要作用。谷氨酸轉運蛋白(GLT)-1作為谷氨酸清除劑,可清除神經傳遞過程中釋放的谷氨酸。有研究報道,在SAH之后GLT-1表達顯著降低,導致谷氨酸積累于細胞間質〔4,5〕。頭孢曲松(CEF)作為一種美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的β-內酰胺抗生素,可增加GLT-1基因的轉錄,并且增強GLT-1表達〔6〕。實驗證實,CEF在缺血性損傷體內模型或體外模型中均具有神經保護作用,通過調節GLT-1表達可能是CEF對SAH的潛在神經保護機制〔7,8〕。本研究通過建立SAH動物模型,探討不同劑量CEF對腦水腫及GLT-1表達的影響和意義。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 雄性成年SD大鼠60只,平均體質量(275±25)g,購于華北理工大學實驗動物中心〔許可證號:SCXK2017-5-012〕,實驗操作均遵守實驗動物道德準則,實驗方案經華北理工大學的動物倫理委員會批準。隨機分為假手術(Sham)組、蛛網膜下腔出血(SAH)組、CEF治療1(0.5 g/kg CEF,C1)組、CEF治療2(1.0 g/kg CEF,C2)組、CEF治療3(2.0 g/kg CEF,C3)組。

1.2動物模型制備 SAH動物模型的制備參照Bederson等〔9〕文獻所描述的血管內穿刺法:用10%的水合氯醛40 mg/kg全麻后,將大鼠以仰臥位固定,頸正中備皮、切開;暴露出右側頸總動脈的分叉處。用血管夾夾閉頸外動脈,在血管夾近端處剪開頸外動脈,將頸外動脈旋轉180 °,將4-0單股尼龍線插入頸內動脈,當刺入18～22 mm時,有突破感,再繼續插入約3 mm,刺穿大腦中動脈與大腦前動脈分叉處,此時停留穿刺線15 s,然后撤出并關閉縫合。Sham組,當刺入感到阻力時,撤出穿刺線,不刺穿血管,其余操作均與SAH模型組相同。

1.3干濕法測定腦組織含水量標本的表面水分 用濾紙吸除,使用分度值0.000 1 g電子分析天平稱重,先稱取其濕重,再置于110 ℃恒溫器中烘烤 24 h,然后稱取其干重,計算出標本的含水量:標本的含水量(%)=(濕重-干重)/濕重 ×100%。

1.4免疫組織化學法檢測GLT-1表達水平 組織切片全部進行常規脫蠟至水處理,并用3%過氧化氫溶液孵育,使內源性過氧化物酶滅活。枸櫞酸鈉緩沖液用于高壓熱修復抗原,先滴加GLT-1一抗,在37 ℃條件下孵育 1 h;再滴加二抗,在4 ℃條件下孵育30 min,加入二氨基聯苯胺(DAB)顯色。陽性結果基于細胞膜上出現棕黃色顆粒為準。使用數碼醫學圖像分析系統Motic Med6.0對其分析,AQP4表達強弱程度用積分光吸收值(IA)表示。

1.5Western印跡檢測 GLT-1表達按照試劑盒說明書嚴格執行:將水腫的腦組織剪碎,放入胞膜提取液中,用研磨器研磨制成勻漿,再用超聲破碎儀進行破碎,每次5 s,共3次,放于離心機中,于4 ℃下離心15 min(4 000 r/min),取其上清液再次離心 1 h(100 000 r/ min),將獲得的粗制膜沉淀物溶解在含有蛋白酶抑制劑的緩沖液中。蛋白濃度用二喹啉甲酸(BCA)測定,先經電泳分離蛋白,再轉膜,然后5% 脫脂牛奶封閉,待封閉液清除后加入一抗(1∶500 GLT-1),4 ℃孵育 12 h,再加入用辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔 IgG 二抗,室溫中孵育30 min,加入電化學發光(ECL)劑,凝膠成像系統使用于分析條帶的相對光吸收值。

1.6統計學方法 采用 SPSS22.0 軟件進行 Student-t檢驗。

2 結 果

2.1各組腦組織含水量比較 與Sham組比較,SAH組腦組織含水量明顯升高(P<0.05);與SAH組比較,C1、C2和C3組腦組織含水量明顯降低(P<0.05);C1、C2和C3組間腦組織含水量差異有統計學意義,且呈劑量依賴性(P<0.05),見表1。

表1 各組腦組織含水量、GLT-1蛋白陽性表達比較

2.2免疫組化檢測GLT-1表達變化 SAH組腦組織神經元和膠質細胞碎裂壞死,GLT-1呈低表達。與Sham組比較,SAH組血凝塊周圍損傷腦組織GLT-1陽性表達顯著降低(P<0.05);與SAH組比較,C1、C2和C3組神經元的形態學改變明顯減輕,血凝塊周圍損傷腦組織GLT-1陽性表達顯著增加(P<0.05);C1、C2、C3組腦組織GLT-1蛋白表達逐漸增加,且呈明顯劑量依賴性(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組GLT-1表達(免疫組化,×400)

2.3Western印跡檢測GLT-1蛋白表達 與Sham組比較,SAH組腦組織GLT-1蛋白表達顯著降低(P<0.05);與SAH組比較,C1、C2和C3組腦組織GLT-1蛋白表達顯著升高(P<0.05),C2組較C1組明顯升高(P<0.05),C3組較C2組明顯升高(P<0.05),見表1、圖2。

3 討 論

SAH引起的中樞神經系統興奮性氨基酸代謝紊亂與損傷后的腦貧血關系密切。本研究結果表明,大鼠SAH后出現明顯腦水腫,且腦組織GLT-1表達明顯降低。GLT-1作為一種谷氨酸轉運蛋白,廣泛表達于神經元軸突末端和星形膠質細胞,可以清除皮質和海馬中釋放的大部分谷氨酸〔10〕。有研究表明,GLT-1 在軸突末端的表達對突觸間隙谷氨酸的信號傳遞、維持突觸前末端的谷氨酸貯存及谷氨酸與其受體的相互作用至關重要〔11〕。谷氨酸過多積聚會造成神經興奮性毒性,與其他離子型受體和代謝性受體結合后引起細胞死亡、氧化應激損傷等一系列毒性作用,隨之可引起一系列中樞神經系統疾病的病理過程,包括SAH早期腦損傷〔12,13〕。Wu等〔14〕研究表明,谷氨酸的興奮性毒性可破壞血腦屏障的完整性,使血腦屏障的通透性增加。SAH誘導嚴重的谷氨酸興奮性毒性,腦脊液中谷氨酸濃度迅速增加,導致血腦屏障被嚴重破壞,從而導致腦水腫的發生。腦水腫是SAH早期腦損傷重要的病理過程之一,它與SAH預后不良顯著相關〔15〕。因此,GLT-1可能是調控SAH后腦水腫的關鍵靶點。

β-內酰胺類抗生素對中樞神經系統疾病有神經保護作用,CEF作為第三代頭孢類抗生素,穿透性強,能很好地穿透血腦屏障〔16〕。有研究顯示,CEF對SAH大鼠模型具有有效的神經保護作用,包括降低死亡率、改善認知功能障礙、抗海馬細胞凋亡等〔17〕。此外,有研究顯示,CEF對興奮性氨基酸轉運體(EAAT)2的表達上調作用具有濃度和時間依賴性,但CEF具體的用量及使用時間并未完全闡明〔18〕。本實驗結果提示,在治療效果上高劑量組優于低劑量組。研究表明,頭孢曲松在腦外傷、腦卒中、肌萎縮性側索硬化等中樞神經系統疾病中可減少神經元損傷及遲發性丟失〔19〕。Durand等〔20〕研究表明,CEF可提高EAAT表達,維持谷氨酸在細胞外的濃度處于正常水平,并清除神經傳遞過程中釋放的谷氨酸鹽,通過此過程可以降低谷氨酸鹽的神經興奮性毒性,避免損害神經元細胞,進而起到保護神經的功能。Zaitse等〔21〕研究發現,作為FDA批準的β-內酰胺類抗生素,CEF增加EAAT基因的轉錄并增強EAAT的表達,從而降低谷氨酸的興奮性毒性,達到保護神經的作用。本實驗結果提示,CEF治療可能通過增加 GLT-1表達和活性,使谷氨酸的興奮性毒性降低,使血腦屏障得以保護,從而減輕腦水腫。

綜上,SAH大鼠腦組織中GLT-1表達明顯下降;CEF治療對SAH的EBI有積極的治療效果,可緩解腦組織水腫;其機制可能與上調GLT-1表達進而抑制谷氨酸的興奮性毒性有關;其治療效果呈劑量依賴性,大劑量治療效果更為顯著。