miR-133b、Bcl-w在老年食管鱗癌中表達及相關機制

張帥 葛曉晴 張進 侯露 楊鯤鵬

(鄭州大學第二附屬醫院胸外科,河南 鄭州 450000)

食管癌是老年人常見的消化系統惡性腫瘤,在2018年全球癌癥統計中,其死亡率和發病率分別排名第七和第六〔1〕。食管癌主要分為食管鱗狀細胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)兩種類型,我國主要以ESCC為主〔2〕。ESCC治療的主要手段有手術治療、化療和放療等,靶向治療是一種目前頗受關注的臨床治療手段〔3〕,但是在ESCC中研究較少,因此探尋ESCC有效的生物治療靶點,制定個體化的治療方案是目前臨床中的迫切需求。

microRNA(miRNA)是一種內源性非編碼小分子RNA,參與細胞增殖、凋亡等過程,目前被認定為腫瘤特異性診斷標志物和治療新靶點〔4〕?，F已發現多種miRNA在食管鱗狀細胞癌中發揮促進或抑制的調節作用〔5〕,但大部分調節機制并不明確。研究發現,miR-133b在多種惡性腫瘤中表達降低,發揮抑癌基因作用,但在ESCC中研究較少。B細胞淋巴瘤(Bcl)-w是一種抑制凋亡的蛋白〔6〕,在細胞凋亡過程的某些環節發揮重要作用。miR-133b可能靶向調控Bcl-w,但是兩者在ESCC中的表達及是否存在靶向調控關系還不清楚。本研究探討miR-133b與Bcl-w在老年ESCC中的表達及相關機制。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 30例ESCC組織及其對應癌旁組織,患者年齡均>60歲,組織取自2020年2月至2021年3月在鄭州大學第二附屬醫院行食管癌手術切除的標本,術前患者未經放化療,術后病理均確診,全部患者知情同意,本研究經鄭州大學第二附屬醫院倫理委員會批準(批準編號:2021109);人食管癌ECA109細胞株(美國ATCC細胞庫);RPMI1604培養基;miR-133b mimics/NC(廣州瑞博生物技術有限公司);Trizol、LipofectamineTM2000(美國Thermo公司);逆轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司);Bcl-w蛋白抗體(美國Santa Cruz公司);GAPDH蛋白抗體(上海康成公司);CCK-8試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海威奧科技有限公司);pGL3-Promoter質粒、pRL-TK(美國Promega公司)。

1.2細胞培養及轉染 將ECA109細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1604培養基中培養, 37 ℃、5%CO2下2 d更換1次舊培養基,培養至對數期,使用0.25%胰蛋白酶消化后傳代。細胞生長密度達80%左右后開始轉染實驗,依據Lipofectamine 2000說明書,分別將miR-133b mimics及陰性對照轉染至ECA109細胞,分別設為miR-133b mimics組及miR-133b NC組,繼續培養。

1.3實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-133b和Bcl-w mRNA表達 引物由上海北諾生物科技有限公司協助合成。取液氮中保存的組織及轉染后的各組ECA109細胞,Trizol法提取總RNA,然后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測各組RNA的完整性,紫外線分光光度計檢測各組RNA濃度。按照反轉錄試劑盒說明書將篩選出來的RNA逆轉錄合成cDNA,以此為模板,使用PCR儀進行擴增。采用兩步法試劑盒(TaKaRa),按照廠家推薦步驟進行PCR擴增。引物序列(5＇-3＇)為:miR-133b正向:CTTTGGTCCCCTTCAACCA,反向:GTGCAGGGTCCGAGGT;U6正向:CGCTTCGGCAGCACATATAC,反向:TTCACGAATTTGCGTGTCAT;Bcl-w正向:GAGCCATATAGTTCCTTGGGA,反向:TAGAATAAGTGGGGAGTGGGA;GAPDH正向:TGACTTCAACAGCGACACCCA,反向:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。檢測miR-133b mRNA表達水平反應條件為:預變性95 ℃ 3 min,變性95 ℃ 12 s,60 ℃退火20 s(共40個循環)。每組設置3個復孔,實驗重復3次。檢測Bcl-w mRNA表達水平的反應條件為:預變性:95 ℃ 5 min,變性95 ℃ 9 s,61 ℃退火20 s(共40個循環)。各組實驗結果采用2-ΔΔCt法分析。其中以U6為內參計算miR-133b mRNA相對表達水平,以GAPDH為內參計算Bcl-w mRNA相對表達水平。

1.4CCK-8檢測細胞增殖能力 收集各組轉染48 h后的ECA109細胞,將轉染后的細胞經胰酶消化后分別接種于96孔板,設置3個復孔,在培養箱中預培養(在37 ℃,5%CO2的條件下),分別于12、24、48、72 h,加入10 μl的10% CCK-8溶液,繼續培養2 h。實驗重復3次,使用酶標儀檢測各組在450 nm處的吸光度(OD)值,繪制細胞增殖曲線。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 將ECA109細胞接種于6孔板中,轉染后培養48 h,胰酶消化后收集細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,細胞濃度至1×106,然后再懸浮在100 μl結合緩沖液中,加入5 μl膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和10 μl碘化丙啶(PI)搖勻,室溫黑暗中培養15 min,進行細胞流式分析檢測。

1.6Western印跡檢測Bcl-w蛋白表達 取氮中保存的組織及轉染后的ECA109細胞,用細胞裂解液提取各組細胞的總蛋白,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),待蛋白分離后轉模至硝酸纖維素膜上,用含5%的脫脂奶粉中封膜1～3 h后,加入已配制好的一抗,4 ℃搖床孵育過夜,TBST洗膜后加入二抗,溫室雜交2 h,TBST洗膜,在硝酸纖維素膜中加入電化學發光(ECL)液,在暗室中曝光,用ImageJ軟件分析Western印跡條帶信號強度(以GAPDH為內參)。

1.7雙熒光素酶報告基因實驗檢測 從培養后未轉染的ECA109細胞中提取總RNA,逆轉錄成cDNA;由上海北諾生物科技有限公司合成Bcl-w 3′URT,PCR擴增出含miR-133b結合位點的Bcl-w 3′URT和miR-133b結合位點突變的3′URT序列。將擴增片段連接至pGL3-Promoter載體中,分別構建pGL3-Bcl-w 3′URT-WT和pGL3-Bcl-w 3′URT-MUT,然后將上述載體分別與pRL-TK 和miR-133b mimics或陰性對照一起共轉染ECA109細胞,于培養箱中培養48 h后檢測熒光強度,分析細胞相對熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.8統計學方法 采用SPSS21.0及Graphpad Prism9.0 軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1ESCC組織中miR-133b mRNA表達 在食管鱗狀細胞癌組織中miR-133b mRNA表達水平(0.328±0.064)明顯低于癌旁組織(0.999±0.008;t=55.793,P<0.001); Bcl-w蛋白在ESCC組織中的表達(0.898±0.374)明顯高于癌旁組織(0.386±0.051,t=6.935,P<0.001)。miR-133b與Bcl-w蛋白表達水平呈負相關(r=-0.792,P<0.01),見圖1、圖2。

圖1 食管鱗狀細胞癌中miR-133b與Bcl-w蛋白表達的相關性

1～2:miR-133b NC組、miR-133b mimics組

2.2轉染miR-133b表達對ESCC細胞中Bcl-w mRNA表達的影響 將miR-133b mimics及應陰性對照組轉染ECA109,qRT-PCR實驗結果顯示,miR-133b mimics組細胞中miR-133b mRNA表達水平明顯高于miR-133b NC組(P<0.001),提示轉染有效。miR-133b mimics組中Bcl-w mRNA相對表達與miR-133b NC組差異無統計學意義(P>0.05)。與miR-133b NC組相比,miR-133b mimics轉染組中Bcl-w蛋白表達發生顯著下調(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 兩組miR-133b、Bcl-w mRNA相對表達量、Bcl-w蛋白表達及ESCC細胞增殖能力比較

2.3miR-133b過表達抑制ESCC細胞的增殖能力 miR-133b mimics組的OD值相比于miR-133b NC組明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4miR-133b過表達促進ESCC細胞凋亡 miR-133b NC組凋亡率〔(5.88±0.82)%〕與miR-133b mimics組〔(16.92±1.59)%〕差異有統計學意義(t=-10.663、P<0.001),表明miR-133b過表達促進ESCC細胞的凋亡。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測miR-133b過表達對ECA109細胞凋亡的影響

2.5Bcl-w是miR-133b作用靶點之一 miRDB和TargetScan在線軟件預測結果提示Bcl-w可能是miR-133b的靶基因(圖4)。雙熒光素酶報告基因分析結果所示(圖5),Bcl-w 3'URT-WT轉染的ECA109細胞中,miR-133b mimics組Bcl-w相對熒光強度(0.521±0.034)明顯低于miR-133b NC組(1.008±0.015;t=32.076,P<0.001);在Bcl-w 3'URT-MUT轉染的ECA109細胞中,miR-133b mimics組Bcl-w相對熒光強度(0.962±0.082)與miR-133b NC組(1.001±0.021)無明顯差異(t=1.260、P>0.05)。提示miR-133b可能靶向調控Bcl-w的表達。

圖4 miR-133b和Bcl-w基因3'UTR存在靶向結合位點

圖5 雙熒光素酶報告基因實驗

3 討 論

盡管目前早期診斷、早期治療的方案已完善,但食管癌患者5年生存率較低,不足30%〔7〕,因此探尋食管癌細胞發生發展的機制,尋找與其相關的新型靶基因,探索新的治療方案具有重要意義。miRNAs是細胞基因表達與轉錄的調節分子,在腫瘤細胞中起到調控的作用〔8〕。miR-133b最初被定義為典型的肌肉特異性微小RNA,研究表明,其參與多種腫瘤的發生與發展〔9〕,Shi等〔10〕收集90例膀胱癌標本,發現膀胱癌組織的miR-133b表達水平顯著低于癌旁組織,miR-133b低表達與膀胱癌臨床病理分期明顯相關,可能與膀胱癌的進展有關。本研究結果與多位學者在其他腫瘤中的研究結果一致〔11,12〕,提示在ESCC中,miR-133b與Bcl-w之間可能存在相互作用關系。

在惡性腫瘤的進展中,腫瘤細胞的惡性增殖與凋亡失調影響著腫瘤的生長,進而促進腫瘤的侵襲與轉移。Yang等〔13〕研究發現,miR-133b在卵巢癌中呈低表達, miR-133b高表達時可以抑制癌細胞的遷移和侵襲能力。Xu等〔14〕發現,腎細胞癌組織和細胞中miR-133b表達減少,miR-133b過表達可以抑制腎細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲,并提高化療敏感性,該機制可能與抑制ERK1/2磷酸化從而降低ERK信號通路活性有關。Wang等〔15〕研究發現,乳腺癌中miR-133b明顯低表達,并進一步研究確定Sox9是miR-133b的直接作用靶點。這些研究表明,miR-133b在不同腫瘤細胞可能介導不同靶基因而發揮抑制癌基因的作用。本研究結果證實轉染有效,上調miR-133b表達明顯抑制ESSC細胞增殖,miR-133b過表達則促進ESCC細胞凋亡。提示miR-133b在ESCC發生發展中發揮重要的調控作用,miR-133b可作為ESCC新的分子治療靶點之一。

Bcl-w是Bcl-2家族成員之一〔16〕,目前Bcl-w的表達下調已被證明能使細胞對凋亡敏感〔6〕。Ding等〔17〕通過對乳腺癌的研究,發現乳腺癌中Bcl-w異常高表達,進一步研究發現,調控Bcl-w的表達可影響乳腺癌細胞的進展。研究發現,Bcl-w基因可作為靶基因受miRNA調控〔18,19〕,但調控機制并不明確。目前認為miRNA與靶基因的作用通常通過抑制翻譯或降解mRNA來實現,當miRNA與mRNA完全互補時,可降解mRNA,使靶基因mRNA表達降低;當miRNA與mRNA部分互補時,一般只抑制其翻譯過程,而不影響mRNA的表達〔20〕。研究發現,ESCC組織中miR-133b與Bcl-w蛋白呈負相關,本研究結果提示,Bcl-w基因的3′UTR與miR-133b存在互補結合位點,Bcl-w可能是miR-133b的靶基因之一。細胞中Bcl-w mRNA的表達不受細胞內miR-133b表達的影響,而細胞內miR-133b高表達時,Bcl-w蛋白表達明顯降低。同時表明miR-133b可與Bcl-w的3'UTR區相應結合位點很好地結合。提示miR-133b可能通過靶向調節Bcl-w蛋白的表達來影響ESCC的功能。

綜上,miR-133b在老年ESCC患者癌組織中表達顯著降低,且miR-133b通過靶向下調Bcl-w蛋白的表達,進而抑制ESCC的增殖并促進其凋亡,但是miRNA在腫瘤中的作用機制十分復雜,仍需對miR-133b的功能及具體機制更深入研究。