基于NLRP3信號通路探究塞來昔布對膝關節炎大鼠滑膜細胞凋亡及神經遞質的作用機制

曹磊 李小平 張磊 費熙 張勁

(武漢市中醫院,湖北 武漢 430000)

骨關節炎具有臨床多見、進展緩慢、不易治愈等特點。膝關節炎的產生多與各種因素所造成的慢性退行性膝關節病變相關,并可導致膝關節軟骨遭到破壞、丟失甚至硬化等多種病理性特征產生,同時伴隨出現囊性病變進而造成骨贅發生。膝關節炎疾病的產生常會伴隨關節發生不同程度的腫脹、疼痛等,同時其病變范圍還涵蓋了關節周圍的肌肉、骨骼、滑膜及韌帶等,最終導致關節功能產生障礙,嚴重者導致關節殘疾、影響患者生活質量〔1,2〕。膝關節炎在人群中的發病率非常高,尤其老年人群較多。膝關節炎的發病原因有多種因素,其中包括年齡、性別等有關,膝關節炎的發生還可能與其負重及過度活動相關〔3,4〕。

目前關于膝關節炎的治療主要是使用非甾體抗炎藥膏劑、貼劑等局部涂抹用藥,可以減輕膝關節的疼痛〔5,6〕。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLRP)3信號通路中的NLRP3炎性小體介導的炎性反應可以對抗外病原性微生物,維持自身穩定〔7〕。滑膜細胞在疾病進程中具有較為關鍵的作用,不僅可在一定程度上釋放細胞因子并使腫瘤樣細胞產生內源性活化,同時其發生的凋亡缺陷也是造成免疫性關節炎疾病進程的關鍵病理機制。單胺類神經遞質包括兒茶酚胺和5-羥色胺兩大類,參與疼痛痛的產生和調節過程。塞來昔布作為環氧合酶(COX)-2的特異性抑制劑,可在一定程度上對炎性前列腺物質合成產生一定的抑制效用,進而起到消炎、止痛的效果,且不良反應較小并在治療中的應用效果較好〔8〕,但其具體作用機制尚不明確。本文探討基于NLRP3信號通路來探究塞來昔布對膝關節炎大鼠滑膜細胞凋亡及神經遞質的影響。

1 材料與方法

1.1動物材料 45只SD大鼠購買于上海代軒生物科技公司〔合格證書為:SCXK(滬)2019-0038〕,體質量200～220 g,溫度(24±1)℃,大鼠單籠喂養,濕度45%～50%,大鼠活動飲水自由,給予大鼠1 w時間習慣新環境,按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2藥物、儀器與試劑 痹祺膠囊(國藥準字Z10910026,規格:0.3 g/粒)天津達仁堂京萬紅藥業有限公司;塞來昔布(國藥準字J20140072,規格:200 mg/粒)輝瑞制藥有限公司;木瓜蛋白酶來自江西江藍純生物試劑公司;酶聯免疫試劑盒來自上海延慕有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色來自北京雷根生物公司;蛋白電泳儀來自北京德元國際科技;一抗、二抗均來自上海歌凡生物科技有限公司。

1.3建模和分組 45只大鼠中隨機選取35只建模:無菌條件下用10 ml生理鹽水與木瓜蛋白酶0.4 g,L-半胱氨酸36 mg同時混勻后冷藏儲存,在建模前30 min常溫靜置。將大鼠仰臥位固定于木板上,3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉后脫毛并消毒,左右膝關節屈曲45 °,以髕骨下級髕腱外緣為進針點,用1 ml注射器向髁間窩方向進針,抵達股骨髁后回撤2 mm,注入混合液0.15 ml,建立關節炎模型。干預4 w后,4組均隨機抽取3只大鼠HE染色,與正常組比較,觀察軟骨細胞的形態變化以判斷造模是否成功〔9〕,實驗過程建模失敗3只,2只死亡。最終分組分為正常組、膝關節炎組、塞來昔布組(塞來組)、痹祺膠囊對照組(痹祺組),每組10只。

1.4干預方法 建模后,塞來組給予塞來昔布4 mg/kg灌胃,痹祺組給予痹祺膠囊0.6 g/kg灌胃,上述藥物均1次/d,各組治療8 w后停止給藥,正常組和膝關節炎組干預給予同體積的生理鹽水。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測 大鼠血液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLRP)3水平大鼠腹主動脈取血置于抗凝管中,4 ℃以轉速為1 000 r/min離心15 min,留取上層血清于-80 ℃冰箱保存備用。采用ELISA測定各組大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、NLRP3的水平。

1.6滑膜組織HE染色 采血后,用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,處死,取滑膜組織,置于4%多聚甲醛液固定24 h,取出已經固定好的椎間盤組織,脫水,甲苯透明,浸蠟包埋、切片取4 μm厚度,用二甲苯脫蠟,水化,水洗5 min,置于蘇木素染色10 min,水洗,再次染色,脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察滑膜組織變化。

1.7Western印跡檢測大鼠滑膜組織中TNF-α、IL-1β、NLRP3表達 取出滑膜組織稱重,于冰上剪碎組織后加入裂解液(每100 mg組織加入800 μl裂解液),冰盒中裂解約30 min,期間每10 min振蕩1次,使其充分裂解,12 000 r/min離心15 min,吸取上清即為蛋白樣品。蛋白樣品,上樣加緩沖液,煮沸15 min。冷卻后上樣(25 μl/孔),凝膠電泳分離蛋白后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,封閉液封閉1 h,一抗TNF-α(1∶1 000)、IL-1β(1∶500)、NLRP3(1∶500)4 ℃孵育過夜,洗滌3次,每次15 min。室溫搖床孵育二抗(1∶3 000)1 h,洗滌3次,每次15 min。電化學發光(ECL)顯影,以GAPDH作為內參,計算與GAPDH比值求得TNF-α、IL-1β、NLRP3蛋白相對表達含量。

1.8滑膜細胞提取 采用組織貼壁培養法分離滑膜細胞,進行培養,先取滑膜組織,剪碎滑膜組織切成約1 mm×1 mm的小塊,放在含0.25%Ⅱ型膠原酶的培養皿中進行消化3 h,混勻細胞懸液以1 000 r/min離心,離心時間10 min,棄上清液,培養基內培養重懸細胞,添加20%胎牛血清,培養箱中培育。待細胞貼壁后,隔日更換1次培養基,倒置顯微鏡下觀察細胞生長。若裂解細胞數達到80%時,按1∶3的比例進行傳代。

1.9TUNEL各組滑膜細胞凋亡 收集滑膜細胞,嚴格依據試劑盒說明進行操作,加入5 μl膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)染料后將其混勻并過濾,室溫避光孵育30 min,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,5 min/次,加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育5 min,PBST清洗,吸干液體后封片并在熒光顯微鏡下隨機選取5個視野,觀察采集圖像。

1.10ELISA大鼠腦組織中神經遞質去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(HT)檢測 滑膜組織取出后,低溫下取下丘腦,生理鹽水清洗后用濾紙吸干〔16〕。使用天平稱取腦組織重量,在加入1 ml生理鹽水的EP管中將組織放入其中制備組織均勻漿,3 000 r/min離心15 min,取上清液,采用ELISA檢測NE、DA、5-HT含量。

1.11統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組血清中炎性因子水平檢測 與正常組相比,痹祺組、塞來組、膝關節炎組TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.05);與膝關節炎組相比,痹祺組和塞來組TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05);與痹祺組相比,塞來組TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05),見表1。

表1 各組血清中炎性因子水平

2.2各組滑膜組織HE染色結果 正常組膝關節形態良好,無明顯損傷。膝關節炎組關節軟骨表面損傷嚴重,并伴隨軟骨細胞排列紊亂、層次模糊、潮線缺失,伴隨大量炎癥細胞浸潤。痹祺組膝關節軟骨表面較整齊,細胞形態仍伴隨一定程度紊亂,軟骨層仍有模糊及潮線缺損現象,且部分區域仍伴隨軟骨細胞缺失及部分空軟骨陷窩。塞來組膝關節軟骨表面趨于平整且細胞排列部分整齊,軟骨層次逐漸清晰,潮線趨于完整,見圖1。

圖1 各組滑膜組織(HE染色,×200)

2.3各組滑膜組織中TNF-α、NLRP3、IL-1β表達 與正常組相比,膝關節炎組、痹祺組、塞來組TNF-α、IL-1β、NLRP3表達水平明顯升高(P<0.05);與膝關節炎組相比,痹祺組和塞來組TNF-α、IL-1β、NLRP3表達水平明顯降低(P<0.05);與痹祺組相比,塞來組TNF-α、NLRP3、IL-1β表達明顯降低(P<0.05),見表2,圖2。

圖2 各組滑膜組織中TNF-α、IL-1β、NLRP3表達

表2 各組滑膜組織中TNF-α、NLRP3、IL-1β表達比較

2.4各組滑膜細胞凋亡情況 與正常組〔(4.32±1.35)%〕比較,膝關節炎組滑膜細胞凋亡率〔(5.01±0.71)%〕無明顯變化(P>0.05);與膝關節炎組比較,痹祺組〔(50.46±5.44)%〕和塞來組滑膜細胞凋亡率〔(74.47±2.40)%〕明顯升高(P<0.05);與痹祺組相比,塞來組滑膜細胞凋亡率明顯升高(P<0.05),見圖3。

圖3 各組滑膜細胞凋亡(TUNEL染色,×200)

2.5各組腦組織中神經遞質表達 與正常組相比,膝關節炎組、痹祺組、塞來組NE、DA、5-HT水平明顯升高(P<0.05);與膝關節炎組相比,痹祺組和塞來組NE、DA、5-HT水平明顯降低(P<0.05);與痹祺組相比,塞來組NE、DA、5-HT水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組腦組織中神經遞質表達

3 討 論

關節炎疾病產生的機制與軟骨細胞外基質的合成、降解等的失衡重要相關,同時,由于外界刺激導致軟骨表面被侵蝕、變薄及其彈性特性損失均是影響疾病發展的主要危險因素之一,但其具體的發病機制仍需進一步明確〔10,11〕。在已經超過65歲的人群中,骨關節炎具有極高的發病率,約占70%;而且隨著人口老齡化的加重和人均壽命的延長,膝關節炎的發病率將進一步升高〔12,13〕。

膝關節炎發生時,滑膜組織中出現大量固有免疫細胞和適應性免疫細胞及他們分泌的炎性因子,引起滑膜組織的炎性增生,繼而造成軟骨組織損傷。且有相關研究顯示,膝關節炎的產生可能與NLRP3的異常表達存在一定聯系〔14〕。NLRP3是NLRP 蛋白家族中的典型代表之一,大量刺激物可以激活NLRP3炎癥小體,包括多種微生物產物、內源性分子或顆粒物質等。大多數學者認為膝關節炎的發病機制由關節的慢性炎癥驅動,導致關節的不可逆破壞。在參與膝關節炎發病機制的幾種細胞因子中,IL-1β是從單核細胞釋放的細胞因子之一,用于誘導和延續關節中的慢性炎癥過程〔15〕。塞來昔布具有抗炎、鎮痛作用。有學者通過對126例膝關節患者進行研究發現,經過口服塞來昔布干預后,患者的臨床癥狀評分顯著降低,炎性因子TNF-α、IL-6水平降低。說明塞來昔布在治療中可通過抑制炎癥釋放進而降低疼痛反應并改善關節功能〔16〕。

邱星罡等〔17〕通過對76例膝關節炎患者進行研究發現,經過雙醋瑞因膠囊聯合塞來昔布干預后,患者的疼痛痛緩解,TNF-α、IL-1水平下降,對膝關節炎有較好的抗炎作用。IL-1和TNF-α作為與炎癥反應相關的細胞因子可參與關節炎疾病的進程,且有研究發現佐劑性關節炎大鼠滑膜組織中NLRP3炎癥小體表達明顯升高,小干擾RNA沉默NLRP3能夠下調NLRP3的表達,并且抑制炎癥因子 IL-Iβ等的分泌〔18,19〕。本研究說明塞來昔布有很好的抗炎作用,并且可能通過調控NLRP3信號通路有關,本文與上述研究一致。

關節炎中發生細胞凋亡能夠在一定程度上造成滑膜組織異常增生,由于關節炎患者的滑膜細胞存在異常凋亡過程不僅和凋亡基因表達異常有關,還和很多分子對凋亡調節作用有關。有研究〔20〕發現針灸可以誘導關節滑膜炎大鼠滑膜細胞的凋亡,可以抑制滑膜炎、阻止對骨質的侵襲,減輕關節炎腫脹,有利于關節炎的恢復。滑膜細胞與關節疾病的產生機制具有一定相關性,其異常凋亡和增殖均會影響關節疾病的進展。有研究發現塞來昔布能夠抑制NLRP3信號通路,降低滑膜-軟骨微環境中的NLRP3炎性小體的表達,增加滑膜細胞的凋亡,可能是塞來昔布抑制滑膜炎癥、阻滯軟骨基質降解,促進軟骨細胞的功能恢復,進而治療膝關節炎〔21〕。袁佳沁等〔22〕研究通過選取培養傳達滑膜細胞,建立關節炎細胞模型,經過藥物清熱利濕通絡方劑干預后發現,滑膜細胞凋亡數量明顯增多,使細胞周期發生阻滯,同時炎性因子水平也明顯下降,說明滑膜細胞凋亡增多,進而改善炎癥,減少關節損害。本研究說明塞來昔布可以增加滑膜細胞凋亡,可能和抑制NLRP3信號通路有關,對膝關節炎治療有一定益處。

下丘腦-垂體-腎上腺素皮質軸作為關鍵的神經內分泌調節系統,可在受到刺激時被異常激活,并可通過適應內環境變化穩定機體的動態平衡。而5-HT作為關鍵的活性物質,在疾病發生時候會各類釋放大量炎癥介質,其中就包括5-HT。膝關節炎發生時,炎癥局部血小板被激活,釋放5-HT、DA、NE。研究證實,經過塞來昔布干預后,患者血清中的5-HT、DA含量明顯下降,改善患者疼痛介質水平,說明塞來昔布對治療膝關節炎有較好的效果〔15〕。本研究證實塞來昔布能夠減移植神經遞質傳遞而減少疼痛反應。

綜上,塞來昔布治療膝關節炎大鼠效果顯著,可以促進滑膜細胞凋亡,降低滑膜組織炎性表達及單胺類神經遞質水平,其作用機制可能與調控NLRP3信號通路有關,關于塞來昔布對NLRP3炎癥小體的相關研究較少,希望本文可以為膝關節炎的研究提供新思路。