GATA結合蛋白6對子宮內膜癌細胞活性的影響及作用機制

路瑤 戴蕾 趙春麗 趙秀芬

(青島大學附屬青島市海慈醫院(青島市中醫醫院) 1產科,山東 青島 266000;2查體科;3婦科)

子宮內膜癌多發于絕經后女性,以異常陰道出血為主要臨床表現,早期可通過手術聯合化療治療,5年生存率可達80%以上,復發性子宮內膜癌或晚期子宮內膜癌患者以保守治療為主,預后較差,5年生存率低于20%〔1〕。針對分子靶點選擇合適的靶向藥物有助于病情控制,同時能夠有效降低治療相關的不良反應,適用于老年子宮內膜癌患者〔2〕。目前關于珠蛋白轉錄因子(GATA)結合蛋白6與腫瘤關系的研究仍處于起步階段,相關研究認為,GATA結合蛋白6參與細胞多種生物學行為,在結卵巢癌、肝細胞癌中高表達,推測可能是一類原癌基因〔3,4〕,但其在子宮內膜癌中表達特點的研究仍十分少見。星形膠質細胞上調基因(AEG)-1在非小細胞肺癌、膀胱癌、食管癌等多種惡性腫瘤中高表達,作為原癌基因可加速腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲,誘導血管生成和耐藥性產生〔5～7〕。本研究旨在探討GATA結合蛋白6對子宮內膜癌細胞活性的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人子宮內膜癌系HEC-151、人子宮內膜上皮細胞hEEC均購于上海蓋寧生物科技有限公司;DMEM細胞培養基、胎牛血清購于廣州英斯特科技有限公司;GATA結合蛋白6過表達質粒、GATA結合蛋白6空載質粒、GATA結合蛋白6 siRNA、GATA結合蛋白6 siRNA陰性對照均購于廣州然科生物有限公司;CCK-8試劑盒、Transwell小室、基底膠均購于武漢多萊泌生物有限公司;總RNA提取試劑盒(Trizol法)購于上海優利科生命科學有限公司;人細胞凋亡調節因子(Bax)單克隆抗體、鼠抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-9單克隆抗體、兔抗人鈣黏蛋白E、波形蛋白單克隆抗體及山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG均購于北京沃卡威生物有限公司。

1.2細胞培養、轉染及分組 人子宮內膜癌系HEC-151、人子宮內膜上皮細胞hEEC復蘇后使用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基,37 ℃ 5%CO2的培養箱中孵育,每24～48 h換液。收集傳代培養的人子宮內膜癌系HEC-151進行細胞轉染和分組:空白對照組(含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基)、GATA結合蛋白6空載質粒組(加入空載體質粒)、GATA結合蛋白6過表達質粒組(加入過表達質粒)、GATA結合蛋白6 siRNA陰性對照組(加入siRNA陰性對照)、GATA結合蛋白6 siRNA組(加入siRNA);8 h后棄去培養基,以含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基繼續培養,取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3細胞增殖和凋亡能力檢測 取傳代的人子宮內膜癌細胞接種于96孔板,密度為1×104個/孔,常規培養24 h,按1.2中方法分組轉染,每組12個重復孔,同時設置12個空白對照孔(僅加培養液),繼續培養24 h,取出后加入CCK-8試劑100 μl/孔,繼續培養2 h,使用全自動酶標儀測量450 nm波長下各孔吸光度值,細胞活力(%)=(實驗組吸光度值-空白對照孔吸光度值)/(空白對照組吸光度值-空白對照孔吸光度值)×100%。取5組人子宮內膜癌細胞接種于24孔板中,密度為1×105個/孔,加入DNA染料PI和熒光染料FITC,室溫下孵育20 min,離心、洗滌后加入磷酸緩沖液,上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.4細胞遷移和侵襲能力檢測 取5組子宮內膜癌細胞接種于24孔板中,常規培養至細胞融合度90%以上,使用200 μl移液槍頭在培養孔中心位置劃一條直線,常規培養24 h,光學顯微鏡下觀察劃痕寬度變化并拍照,測量細胞遷移距離。取5組人子宮內膜癌細胞接種于Matrigel基底膠包被過的 Transwell上室,常規培養至細胞貼壁生長后更換為無血清培養基,Transwell下室中加入含10%胎牛血清的培養基,培養24 h后Transwell下室中的細胞漂洗、固定、結晶紫染色,光學顯微鏡下觀察計數。

1.5RT-聚合酶鏈反應(PCR)檢測GATA結合蛋白6、AEG-1 mRNA表達 總RNA提取試劑盒收集人子宮內膜癌系HEC-151、人子宮內膜上皮細胞hEEC及5組人子宮內膜癌細胞的總RNA,逆轉錄得到cDNA。GATA結合蛋白6上游引物:5′-CGTAAGACCTGTTATTCTGTCCCTA-3′,下游:5′-TAAAG-AAGGATGACGTATGACTATC-3′。AEG-1上游引物:5′-GGAACTCGCTACGTACGGTACGGCT-3′,下游:5′-CCGATAGCCGTACGAACCATGCCATC-3′。GAPDH上游引物:5′-GCACAGGGTGATTTAAGGGACC-3′,下游:5′-CGTG AGCCTAACGTGTTCTAGCG-3′。PCR體系20 μl,包括dNTP反應混合物5 μl、上游及下游引物各1 μl、模板DNA 4 μl、雙蒸餾水9 μl。擴增條件:94 ℃預變性5 min,95 ℃變性40 s,59 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,循環數30個。以內參基因GAPDH為標準進行相對定量。

1.6Western印跡檢測Bax、Caspase-9、鈣黏蛋白E、波形蛋白表達 RIPA細胞裂解液提取5組人子宮內膜癌細胞的總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度,行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉法將目標蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜,使用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h,滴加兔抗人Bax單克隆抗體(稀釋倍數1∶700)、鼠抗人Caspase-9單克隆抗體(稀釋倍數1∶500)、兔抗人鈣黏蛋白E單克隆抗體(稀釋倍數1∶1 000)、兔抗人波形蛋白單克隆抗體(稀釋倍數1∶500)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(稀釋倍數1∶2 000),4 ℃孵培育過夜,次日滴加山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG,稀釋倍數1∶5 000,室溫下1 h,電化學發光法(ECL)顯影,使用Image J軟件讀取各條帶的灰度值。

1.7統計學分析 使用SPSS25.0統計學軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1人子宮內膜癌細胞與人子宮內膜上皮細胞中GATA結合蛋白6、AEG-1 mRNA表達水平比較 人子宮內膜癌細胞中GATA結合蛋白6 mRNA、AEG-1 mRNA表達水平(2.61±0.27、2.37±0.24)高于人子宮內膜上皮細胞(1.05±0.09、1.07±0.11),差異有統計學意義(t=17.438、15.218;均P=0.000)。

2.2各組人子宮內膜癌細胞增殖、凋亡能力比較 GATA結合蛋白6過表達質粒組細胞活力明顯高于GATA結合蛋白6空載質粒組、空白對照組,細胞凋亡率明顯低于GATA結合蛋白6空載質粒組、空白對照組(P<0.01);GATA結合蛋白6 siRNA組細胞活力明顯低于GATA結合蛋白6 siRNA陰性對照組,細胞凋亡率明顯高于GATA結合蛋白6 siRNA陰性對照組(P<0.01)。見表1。

表1 各組人子宮內膜癌細胞增殖、凋亡能力、細胞遷移距離、侵襲細胞數、GATA結合蛋白6、AEG-1 mRNA比較

2.3各組細胞遷移、侵襲能力比較 GATA結合蛋白6過表達質粒組細胞遷移距離、侵襲細胞數明顯高于GATA結合蛋白6空載質粒組、空白對照組(P<0.01),GATA結合蛋白6 siRNA組明顯低于GATA結合蛋白6 siRNA陰性對照組(P<0.01)。見表1。

2.4各組GATA結合蛋白6、AEG-1 mRNA表達水平比較 GATA結合蛋白6過表達質粒組GATA結合蛋白6、AEG-1 mRNA表達水平明顯高于GATA結合蛋白6空載質粒組、空白對照組(P<0.01),GATA結合蛋白6 siRNA組明顯低于GATA結合蛋白6 siRNA陰性對照組(P<0.01)。見表1。

2.5各組細胞凋亡蛋白及上皮間質轉化標志蛋白表達水平比較 GATA結合蛋白6過表達質粒組Bax、Caspase-9、鈣黏蛋白E表達水平明顯低于空白對照組、GATA結合蛋白6空載質粒組,波形蛋白表達水平明顯高于空白對照組、GATA結合蛋白6空載質粒組(P<0.01);GATA結合蛋白6 siRNA組Bax、Caspase-9、鈣黏蛋白E表達水平明顯高于GATA結合蛋白6 siRNA陰性對照組,波形蛋白表達水平明顯低于siRNA陰性對照組(P<0.01)。見表2、圖1。

1～5:空白對照組,GATA結合蛋白6空載質粒組,GATA結合蛋白6過表達質粒組,GATA結合蛋白6 siRNA陰性對照組,GATA結合蛋白6siRNA組

表2 各組人子宮內膜癌細胞凋亡蛋白及上皮間質轉化標志蛋白表達水平比較

3 討 論

我國子宮內膜癌的發病率位居女性生殖系統惡性腫瘤的第二位,且呈上升趨勢,以中老年患者為主〔8〕。早期子宮內膜癌治療以手術為主,包括切除子宮、宮頸、卵巢、輸卵管及相應淋巴結清掃。晚期患者預后較差,腫瘤細胞轉移、侵襲是患者不良預后的主要原因〔9〕;探索新的治療靶點,對降低復發率、改善患者預后、延長生存時間具有重要意義。GATA結合蛋白包括6個家族成員,可分為兩個亞群(GATA結合蛋白1～3、GATA結合蛋白4～6),其中GATA結合蛋白1～3主要作用于造血系統、神經系統、免疫系統,調控淋巴細胞分化、造血系統正常運轉等過程〔10〕;GATA結合蛋白4～6發揮細胞增殖、分化、凋亡調控作用。AEG-1是一種具有多種生物學功能的致癌基因,參與誘導肝癌、前列腺癌、膠質瘤等多種惡性腫瘤的發生與發展,調控腫瘤細胞增殖、遷移、耐藥等行為〔11〕。研究者下調AEG-1表達后能夠增強肺腺癌耐藥細胞株A549對5-氟尿嘧啶(FU)的敏感性〔12〕。

本研究結果提示人子宮內膜癌細胞中GATA結合蛋白6、AEG-1高表達,可能參與調控細胞增殖、遷移等過程。進一步分析說明GATA結合蛋白6表達直接影響到子宮內膜癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡過程,低表達能夠抑制子宮內膜癌細胞活性,加速凋亡,有助于抑制病情進展。另外,本研究結果推測人子宮內膜癌細胞中GATA結合蛋白6表達與AEG-1表達呈正相關,GATA結合蛋白6高表達可能通過上調AEG-1表達來提升子宮內膜癌細胞的活性。

細胞凋亡是細胞重要的生理過程,Bax蛋白屬于Bcl-2家族,是一種促細胞凋亡因子,可通過誘發線粒體外膜透化來加速細胞凋亡,活化的Bax蛋白還能夠釋放凋亡信號分子〔13〕。目前從人體細胞中已發現十幾種Caspase酶,參與細胞裂解、凋亡過程〔14〕。Caspase-9是細胞凋亡信號的啟動酶,活化后能夠產生信號級聯反應〔15〕。上皮間質轉化是腫瘤細胞轉移、侵襲過程的主要步驟,其水平強弱直接影響到腫瘤細胞的轉移、侵襲能力〔16〕。鈣黏蛋白E、波形蛋白是上皮間質轉化標志物,鈣黏蛋白E是一種鈣離子依賴的糖蛋白,參與胚胎發育中細胞識別、遷移過程〔17〕;波形蛋白在維持細胞骨架完整性和細胞正常生理功能方面發揮重要作用。本研究結果提示GATA結合蛋白6能夠介導人子宮內膜癌細胞的凋亡和上皮間質轉化過程,進而影響凋亡和侵襲能力。結合上述研究可推測下調GATA結合蛋白6表達可能通過抑制AEG-1表達,減弱人子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進細胞凋亡。