丙泊酚基于TLR4/Foxo1信號通路改善心肺轉流術介導的認知功能障礙

鄭育秀 劉麗麗 黃澤波 王濤 劉莉芳

(海南醫學院第二附屬醫院麻醉科,海南 海口 570311)

心肺轉流術(CPB)是將血液引出至體外,經體外氧合后重新輸回動脈系統的生命支持技術,現已被不斷應用于心臟、動脈等手術中〔1〕。然而,CPB是目前公認的最易誘發術后認知功能障礙(POCD)的手術〔2〕。POCD臨床癥狀包括焦慮、神經功能損傷、記憶能力衰退,嚴重影響患者的康復,并限制了CPB的應用。由于海馬神經元狀態對于維持正常的認知功能至關重要,海馬神經元炎癥與凋亡是POCD形成的主要原因〔3〕。因此,探索潛在的海馬神經元保護劑治療POCD是擴大CPB在臨床中應用的關鍵。丙泊酚是一種起效快、誘導平穩、易蘇醒的麻醉藥物,廣泛應用于外科患者的麻醉和重癥監護室患者的鎮靜。研究表明,低劑量丙泊酚具有潛在的神經保護作用,且已在缺血性腦卒中模型中得到許多文獻的證實〔4,5〕。然而,低劑量丙泊酚對CPB模型誘導POCD的影響的研究尚少。本研究探究丙泊酚對CPB誘導POCD的改善機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 選用48只SD大鼠,12月齡,體質量500～600 g,SPF級。由海南藥物研究所有限責任公司提供,生產許可證號:SCXK(瓊)2020-0007。所有大鼠入組后喂養于海南醫學院動物實驗中心動物飼養室,使用許可證號:SYXK(瓊)2017-0013。飼養環境溫度(24±2)℃,濕度(60±5)%,自由飲食攝水。1 w后,將大鼠隨機分為對照(Control)組,模型(Model)組,丙泊酚組,丙泊酚+LY294002(Propofol+LY294002),每組12只。CBP模型構建前,丙泊酚+LY294002組大鼠連續3 d鼻滴LY294002,10 μg/只。CBP模型構建當日,以3%七氟烷麻醉大鼠,構建CPB模型。結束后取丙泊酚,丙泊酚+LY294002組尾靜脈注射20 mg/kg丙泊酚。術中嚴格執行無菌操作,術后3 d腹腔注射青霉素鈉。對照組不做任何處理。在CBP構建后第31～35 d開展Morris水迷宮測試。取6只大鼠腦組織以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測炎性細胞因子含量。取3只大鼠腦組織切片,通過電生理測試檢測海馬突觸活性的長時程增強。取3只大鼠腦組織切片,采用尼氏(Nissl)染色檢測海馬區神經元狀態。最后,利用Western印跡檢測相關蛋白表達。動物實驗均遵循3R原則,且符合國家衛生部動物保健研究所的指導方針,并經海南醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準。

1.2主要試劑與儀器 丙泊酚(美國Sigma公司,批號:56931);LY294002(美國MCE公司,批號:846739);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-1β ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術公司,批號:3003-2793,3005-5943,3009-4831);Nissl染色試劑盒(北京索萊寶生物技術公司,批號:G2830);Anti-Toll樣受體(TLR)4抗體、Anti-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抗體、Anti-p-PI3K抗體、Anti-蛋白激酶B(Akt)抗體、Anti-p-Akt抗體、Anti-叉頭蛋白(Fox)O1抗體、Anti-p-Foxo1抗體、Anti-肌動蛋白(β-actin)抗體(北京博奧森生物技術公司,批號:b38729,b34304,b39201,b30439,b39483,b38493,b39843,b38490);Morris水迷宮(江蘇賽昂斯生物科技公司,型號:SA201);膜片鉗系統(Axon,PClamp10.1 記錄分析軟件,MultiClamp 700B 放大器,MultiClamp 1550B 放大器);酶標儀(Thermo,型號:Fc);光學顯微鏡(OLYMPUS,型號:BX53);電泳裝置(美國Biorad公司,型號:Mini-protean Tetra);化學發光成像儀(上海天能生物公司,型號:5200)。

1.3CPB模型構建 CPB裝置主要由貯血器、蠕動泵、膜式氧合器構成,整個系統預充由乳酸林格溶液:6%羥乙基淀粉:甘露醇:碳酸氫鈉=11∶7∶1∶1的混合溶液。參考文獻〔6〕中大鼠CPB-POCD模型構建方案,將大鼠麻醉后,氣管插管并接呼吸機通純氧氣,設置呼吸頻率60次/min。大鼠腹部皮膚消毒備皮,分離出雙側股動脈,左側股動脈穿刺置管并固定,注射300 U/kg肝素并監測動脈血壓,右側股動脈用于血液動脈灌注。大鼠頸部皮膚消毒備皮,分離右側頸內靜脈并置管,緩慢插向心臟使導管前端位于右心房處,結扎固定套管。開始CPB,將右心房血液引流至貯血器,經蠕動泵泵入氧合器再經右股動脈回輸,設置流速約100 ml/(kg·min)。氧合器以0.2 L/min純氧供氧,整個過程維持大鼠恒溫38～39 ℃。60 min后,停止CPB,待血流動力學穩定后逐層縫合傷口。對照組完全麻醉后,備皮消毒,分離出雙側股動脈與右側頸靜脈,左側股動脈穿刺置管,連接壓力表監測平均動脈壓(MAP),維持60 min。

1.4Morris水迷宮測試 Morris水迷宮儀器是1個直徑1.2 m、深50 cm的圓形水池,分4個象限。第Ⅰ象限中設置1個低于水面1 cm、直徑12 cm的平臺,水池壁上貼有不同圖形幫助大鼠游泳時定位。訓練期間,將大鼠自各個象限依次投入水中,記錄大鼠90 s內尋找平臺時間,取平均時間記為逃避潛伏期,共4 d。測試期間,撤去平臺,將大鼠自第Ⅲ象限區域投入水中,記錄大鼠90 s內首次到達平臺時間、穿越平臺次數、第Ⅰ象限停留時間。

1.5海馬神經元電生理檢測 將大鼠處死后使用預冷的氧飽和高糖切片緩沖液心臟灌流,取腦組織制備橫向海馬切片,約400 μm。參考文獻〔7〕測試方法,將切片轉移至32 ℃的氧飽和人工腦脊液(ACSF)中平衡。在腦組織 CA1 區使用聚四氟乙烯涂層的鎢絲單極電極(A-M Systems)以 0.017 Hz(雙相脈沖,0.1 ms 半波持續時間)刺激沙弗側支連合通路引起基線場興奮性突觸后電位(fEPSPs)。用充滿 ACSF 的玻璃微電極記錄。在基線記錄期間,調整刺激強度以引發 fEPSP,初始斜率值為 200 μA 電流時引發的最大值的 40 %,固定電極與刺激強度。在基線穩定記錄20 min后, 應用高頻刺激誘發長時程增強(LTP),連續20串高頻脈沖,每串包含200個脈沖,頻率為200 Hz,波寬200 μs,串間隔30 s,高頻刺激連續記錄60 min。

1.6炎癥細胞因子測試 大鼠麻醉后取海馬組織,加入預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)勻漿,離心(12 000 r/min,30 min),取上清液,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度。根據TNF-α,IL-6與IL-1β試劑盒說明書,在預包被板ELISA板中加入檢測樣品與檢測抗體,孵育1.5 h,加入辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素孵育30 min,每孔加入顯色底物四甲基聯苯胺(TMB),10 min后加入終止液,在450 nm處檢測最大吸收波長。

1.7Nissl染色 將大鼠處死后,使用預冷的PBS灌注,以多聚甲醛固定后石蠟包埋,切片。取石蠟切片脫蠟至水,將切片浸入焦油紫染色液中,將染缸于56 ℃下浸染1 h,去離子水沖洗,將切片浸入尼氏分化液中分化1 min,無水乙醇迅速脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡下拍照。

1.8Western印跡 將大鼠處死后取海馬區組織,加入裂解液勻漿,離心(12 000 r/min,30 min),取上清液,加入5×上樣緩沖液沸水浴10 min。取十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行電泳實驗,每孔樣品上樣10 μg。濕法轉膜將凝膠上蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,4 %脫脂奶粉封閉2 h,4 ℃條件下一抗稀釋液孵育過夜。次日,室溫條件下,二抗稀釋液孵育1 h。將發光液均勻地滴在PVDF膜上,自動成像儀成像。結果用ImageJ軟件定量分析,以目標蛋白灰度值與β-actin的灰度值比值作為最終量化統計結果。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析(One Way ANOVA)、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1丙泊酚對CPB-POCD大鼠學習記憶功能的影響 各組經歷了多日的水迷宮訓練后,逃避潛伏期均明顯減少(P<0.05)。與對照組相比,模型組逃避潛伏期在第3天與第4天均出現了明顯的增加(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚組在第4天逃避潛伏期明顯減少(P<0.05);與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY-294002組在第4天逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)。水迷宮測試中,與對照組相比,模型組首次到達平臺時間明顯增加(P<0.05),第Ⅰ象限停留時間與穿越平臺次數明顯減少(P<0.05)。與模型組相比,丙泊酚組首次到達平臺時間明顯減少(P<0.05),第Ⅰ象限停留時間明顯增加(P<0.05),穿越平臺次數增加,但差異無統計學意義(P>0.05)。與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY294002組首次到達平臺時間明顯增加(P<0.05),第Ⅰ象限停留時間明顯減少(P<0.05),穿越平臺次數減少,但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組水迷宮訓練中逃避潛伏期及測試指標比較

2.2丙泊酚對CPB-POCD大鼠長時程電位的影響 與對照組相比,模型組長時程電位明顯降低(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚組長時程電位明顯增加(P<0.05);與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY294002組長時程電位明顯減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組長時程電位比較

2.3丙泊酚對CPB-POCD大鼠海馬區神經元狀態的影響 對照組海馬CA1區Nissl染色顯示,神經元密集且細胞間排列整齊,數量密集,細胞質輪廓清晰,且胞質中Nissl體數量較多;模型組神經元數量較少,細胞膜破裂且鮮有Nissl體分布;與模型組相比,丙泊酚組海馬CA1區神經元狀態明顯改善,而丙泊酚+LY294002組海馬CA1區神經元出現損傷。見圖2。

圖2 各組海馬CA1區神經元(Nissl染色,×100)

2.4丙泊酚對CPB-POCD大鼠炎性細胞因子的影響 與對照組相比,模型組腦組織中IL-6、IL-1β與TNF-α含量明顯增加(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚組腦組織中IL-6、IL-1β與TNF-α含量明顯減少(P<0.05);與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY294002組腦組織中IL-6、IL-1β與TNF-α含量明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織中炎性細胞因子含量及海馬區TLR4/Akt/FoxO1信號相關蛋白表達量比較

2.5丙泊酚對CPB-POCD大鼠海馬TLR4/FoxO1與PI3K/Akt蛋白表達的影響 與對照組相比,模型組海馬中TLR4表達明顯增加,p-PI3k、p-Akt、p-FoxO1表達明顯減少(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚組海馬中TLR4表達明顯減少,p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1表達明顯增加(P<0.05);與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY294001組海馬中TLR4表達明顯增加,p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1表達明顯減少(P<0.05)。見表2、圖3。

1～4:對照組、模型組、丙泊酚組、丙泊酚+LY294002組

3 討 論

CPB誘導的POCD嚴重降低心臟手術患者的生活質量,限制CPB在臨床上的應用。研究調查顯示,有3%～6%經歷CPB的患者會出現明顯腦功能缺陷癥狀,部分患者腦損傷率可高達60%～70%,且約有30%患者POCD癥狀會持續到6個月以上〔8〕。POCD患者臨床表現為焦慮、神經功能損傷、記憶能力衰退。本研究結果提示,CPB-POCD模型大鼠學習、記憶功能明顯損傷,即本研究POCD模型構建成功。

Meta分析顯示,老齡患者的外科手術過程中,丙泊酚會引起POCD,其機制可能涉及GABA受體功能增強,海馬神經元突觸的長時程增強抑制〔9〕。此外,170 mg/kg丙泊酚麻醉2 h會導致老齡小鼠遠期的β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積,造成神經元凋亡〔10〕。且150 mg/kg丙泊酚連續注射30 d會不可逆得引起小鼠運動功能障礙〔11〕。因此,高劑量丙泊酚麻醉會誘導神經元凋亡并造成POCD。然而,丙泊酚也被發現具有神經保護作用,其機制主要涉及維持細胞骨架的穩定性,從而抑制POCD發生〔10〕。腦卒中研究顯示,15 mg/kg丙泊酚通過調控炎癥小體(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1信號通路,抑制炎性小體的生成,發揮神經功能保護作用〔12〕。帕金森病研究中,100 mg/kg丙泊酚通過調控抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤(Bcl)-2表達與促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達,減少帕金森病小鼠黑質多巴胺能神經元凋亡〔13〕。因此,丙泊酚的治療作用與不良反應主要與其劑量相關。本研究中丙泊酚劑量為20 mg/kg,屬于較低的應用劑量,展現中樞神經的保護作用,逆轉了CPB手術造成的大鼠POCD癥狀。

TNF-α、IL-6、IL-1β是一類調節機體炎癥和免疫應答的細胞因子,廣泛分布于中樞神經系統中,引發神經系統炎性反應,是POCD發病的重要病理因素之一〔14〕。TLR4作為一種模式識別受體,在與其配體結合后會招募信號適配器并啟動一系列信號級聯反應,導致炎性細胞因子的釋放。PI3K/Akt信號通路則通過抑制TLR4活化在機體內抗炎癥反應作用,其中涉及轉錄因子FoxO1的調控〔15〕。FoxO1通過與TLR4基因多個增強子原件結合,活化TLR4信號。而PI3K激活則誘導Akt活化,引起FoxO1磷酸化而失活,從而抑制TLR4信號通路,形成一個炎癥的負反饋調控機制〔16〕。研究顯示,黃芩苷可以通過活化PI3K/Akt/FoxO1表達引起小膠質細胞中TLR4表達下調〔17〕。因此,本研究認為丙泊酚調節CPB誘導的POCD是通過活化PI3K/Akt信號通路介導的。

綜上,丙泊酚以劑量依賴的方式影響海馬神經元,低劑量的丙泊酚通過活化PI3K/Akt信號通路,增加FoxO1的磷酸化,從而減少TLR4表達,減輕了CPB誘導炎癥反應與POCD癥狀。