維生素D聯合益生菌對中老年大鼠骨代謝的影響

楊佳霖 全貞玉

(延邊大學醫學院,吉林 延邊 133002)

骨骼的動態轉化過程稱為骨代謝〔1〕。骨代謝的平衡是維持人體骨骼健康的重要基石,骨穩態受成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收共同調控〔2〕。骨質疏松是一種骨形成和骨吸收失衡所導致的代謝性、全身性骨骼疾病,表現為骨量減少、骨組織微結構退變,繼發骨脆性增加,極易出現病理性骨折〔3〕。骨質疏松發生與多種因素有關,其主要危險因素為長期缺乏運動、雌激素下降及飲食結構不合理等〔4〕。目前全球已進入老齡化社會,骨質疏松已成為位居第三位的慢性疾病〔5〕。藥物治療在減緩骨質流失,預防骨質疏松方面取得一定療效,但都有一定副作用〔6〕。尋找一種新的行之有效的骨質疏松治療方法十分必要。維生素(Vit)D對骨骼的保護作用已經得到了證實。近年來,益生菌在臨床方面的用途受到廣泛關注,有研究表明腸道菌群與腸道屏障等相互作用影響鈣吸收,對骨骼有保護作用〔7〕。本研究通過補充VitD和益生菌探討其聯合對骨代謝的影響及對骨骼的保護作用,基于腸道菌群的變化研究腸道菌群與骨質疏松的關系,為VitD聯合益生菌防治骨質疏松提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 25-羥維生素D(上海賽可銳生物科技有限公司),達益喜【衡】益生菌(江蘇微康生物科技有限公司),大鼠VitD3、大鼠血鈣血磷、大鼠Ⅰ型膠原交聯C末端肽(CTX)、大鼠骨特異性堿性磷酸酶(B-ALP)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(上海優選生物科技有限公司),大鼠血清鎂試劑盒(貝博生物科技有限公司);全波段Biotech酶標儀(美國公司),Micro-CT(日本Rigaku公司)。

1.2實驗動物分組 13月齡SPF級雌性SD中老年大鼠32只,體質量在330～380 g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司,動物許可證號:SCXK(遼)2020-0001。 隨機分成對照組、VitD組、益生菌組和VitD+益生菌組,每組8只。

1.3實驗試劑制備和給藥方法 VitD灌胃溶液:精確稱取VitD3 0.2 mg,加入花生油1 ml,充分混勻,使維生素完全溶解,即得到濃度為200 μg/ml的維生素儲備溶液,將其放入4 ℃冰箱保存。灌胃時吸取儲備溶液1 μl,加入1 ml花生油進行稀釋即可得到濃度為0.2 μg/ml的維生素D灌胃溶液。益生菌灌胃溶液:稱取2 g益生菌粉,其中含有益生菌2×1010CFU,溶于20 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中,離心機搖勻,得到濃度為 1×109CFU/ml的益生菌灌胃溶液。對照組灌胃PBS和花生油,VitD組灌胃PBS和VitD溶液,益生菌組灌胃益生菌溶液和花生油,VitD+益生菌組灌胃益生菌溶液和維生素D溶液,連續4 w。益生菌于每日上午10點灌胃,灌胃濃度為1×109CFU/ml,每只大鼠灌胃1 ml〔8〕,VitD于每日下午2點灌胃,灌胃濃度為0.2 μg/ml,灌胃劑量為0.5 ml/kg〔9〕。

1.4檢測樣品制備 4 w后腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,記錄體質量,經腹主動脈取血,3 000 r/min離心10～15 min,取上清,于-80 ℃凍存待測。用銳利器械分離右側股骨,快速剝離股骨上附著的肌肉和結締組織,放入-80 ℃冰箱保存待測,實驗結束前1 d,收集大鼠新鮮糞便置于無菌PE管中,注意避免毛發污染,保存于-80 ℃冰箱中凍存待測。

1.5血清礦物質指標檢測 使用大鼠血鈣、血磷ELISA試劑盒檢測血清中鈣、磷的含量,具體步驟按照說明書,用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度。使用血清鎂試劑盒測定大鼠血清鎂含量,具體步驟及公式按照說明書進行,用酶標儀在600 nm波長下測定吸光度。

1.6血清骨代謝相關酶檢測 采用大鼠CTX ELISA試劑盒、大鼠B-ALP試劑盒檢測CTX、B-ALP含量,實驗步驟按說明書進行,用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度。

1.7骨組織參數檢測 將大鼠股骨放入Micro-CT掃描儀中,掃描部位為股骨頭,設置分辨率為10 μm,掃描時間為5 min,輸入其他相應參數后,確保股骨頭處于掃描畫框內后開始掃描,得到掃描CT圖像,利用Ctan軟件得到骨組織參數,包括骨密度(BMD)、骨體積(BV)、所選ROI體積(TV)、相對骨體積(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、結構模型指數(SMI)。

1.8糞便腸道菌群檢測 大鼠腸道菌群檢測委托于北京諾禾致源科技股份有限公司進行檢測,檢測大鼠腸道菌群的組成、菌種和菌屬。選擇擴增區域為16 S V4區,引物序列為正向:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′,反向:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。測序得到原始數據后,對原始數據進行拼接、過濾,得到有效數據;然后基于有效數據通過DADA2進行降噪,獲得ASVs特征序列,采用QIIME2的classify-sklearn算法對每個ASV使用Naive Bayes分類器進行物種注釋,根據ASVs注釋結果和各種特征表,獲得腸道菌群界、門、綱、目、科、屬、種各水平物種信息。

1.9統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。大鼠BMD和骨組織參數使用CTan軟件進行分析。

2 結 果

2.1各組一般情況 實驗過程中各組均毛發濃密富有光澤,精神狀態良好,行動敏捷,活動量、飲水量和攝食量無明顯差異,灌胃前后各組體質量無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組灌胃前后體質量

2.2各組血清礦物質水平 與對照組比較,VitD+益生菌組的血清鈣水平明顯升高(P<0.05)。各組血清、磷、鎂無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組血清礦物質水平及骨代謝生化指標比較

2.3各組骨代謝生化指標及骨密度水平 與對照組相比,VitD組、益生菌組和VitD+益生菌組血清CTX水平明顯降低(P<0.05);與VitD組和益生菌組相比,VitD+益生菌組血清CTX水平明顯降低(P<0.05)。與對照組相比,VitD組、益生菌組和VitD+益生菌組血清B-ALP水平明顯升高(P<0.05),與VitD組和益生菌組相比較,VitD+益生菌組血清B-ALP水平明顯升高(P<0.05)。對照組相比較,益生菌組、VitD組和VitD+益生菌組BMD水平明顯升高(P<0.05)。VitD+益生菌組的BMD水平顯著高于VitD組和益生菌組(P<0.05)。見表2。

2.4各組骨組織形態計量學參數結果 與對照組相比,VitD組和VitD+益生菌組BV/TV值明顯升高(P<0.05),VitD組、益生菌組和VitD+益生菌組Tb.Th明顯升高(P<0.05),VitD+益生菌組的Tb.Th顯著高于VitD組和益生菌組(P<0.05)。與對照組、VitD組和益生菌組相比,VitD+益生菌組Tb.Sp明顯升高(P<0.05)。與對照組相比,益生菌組和VitD+益生菌組SMI值明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組骨組織形態計量學參數比較

2.5各組腸道菌群變化情況 圖1顯示門水平上4組腸道菌群分布最多的是厚壁菌門(Firmicutes),其次為擬桿菌門(Bacteroidota)。圖2表明4組中乳桿菌屬(Lactobacillus)富集顯著為優勢菌,其中VitD+益生菌組中乳桿菌屬占比最高,約占序列總數的25%。益生菌組和VitD+益生菌組的Chao1指數顯著高于VitD組和對照組(P<0.05)。益生菌組的shannon指數顯著高于VitD組(P<0.05)。見表4。PCA分析發現對照組和VitD組距離較近,表明對照組和VitD組的腸道菌群組成相似;益生菌組和VitD+益生菌組與其他組距離較遠,菌群組成相似度較低。見圖3。NMDS統計反映群落結構4組樣本重合部分較少,聚類圈顯示聚集傾向不同,說明4組腸道菌群組成是不同的。見圖4。

圖1 門級物種相對豐度

圖2 屬級物種相對豐度

圖4 腸道菌群NMDS分析

表4 各組腸道菌群多樣性

3 討 論

骨質疏松發生機制是礦物質代謝異常,鈣攝入過低,鎂攝入較高可能是骨質疏松發生的主要原因之一〔10〕,血鈣、血鎂、血磷都是與骨代謝相關的礦物質,三者互相聯系、互相制約。研究表明腸道菌群可發酵食物產生短鏈脂肪酸,降低腸道局部pH,從而促進鈣吸收〔11〕。Ghanem等〔12〕實驗結果顯示食用益生菌可以使血漿中的鈣含量顯著增加,但食用益生菌對磷、鎂含量影響不大。本研究結果也證明了這一點,VitD和益生菌可增加血清中鈣的水平,聯合應用效果更佳。

骨代謝指標是骨組織的代謝產物,骨生理狀態變化的敏感指標,該指標有助于鑒別原發性和繼發性骨質疏松,判斷骨轉換類型、預測骨丟失狀況〔13〕。臨床上常見的骨代謝標志物主要包括VitD、CTX、N端骨鈣素(N-MID)、B-ALP等〔14〕。VitD對骨的保護作用已得到充分證實,研究表明長期缺乏VitD會導致低鈣血癥和低磷血癥,造成與軟骨病或軟骨病相關的骨礦化受損〔15〕。CTX含量與骨吸收程度相關,是骨吸收的特異性、敏感性指標,反映了破骨細胞活性,CTX含量越高表明破骨細胞的活性越高,骨吸收越活躍。B-ALP參與骨形成過程,是骨形成較靈敏標志物之一,血清B-ALP測定可為骨質疏松的早期診斷、治療效果和預后情況提供依據〔16〕。有研究表明益生菌可改善絕經后婦女的骨密度,降低血清CTX含量,且不會增加不良反應發生,對預防絕經后骨質疏松有一定作用〔17〕。本實驗結果顯示,補充VitD和益生菌可影響實驗大鼠CTX和B-ALP水平,從而有助于維護骨骼健康。

腸道菌群影響骨代謝的主要途徑包括其改善腸道通透性,促進營養物質吸收,調節免疫等〔18〕。益生菌通過改變腸道菌群,從而影響免疫系統,炎癥因子與成骨細胞、破骨細胞關系密切,當腸道菌群變化時,相應的炎癥因子水平改變,成骨和破骨細胞的數量隨之改變〔19〕。益生菌和VitD具有協同作用,益生菌可以增加宿主體內VitD和VitD受體表達及其活性〔20〕。益生菌能夠影響骨代謝,改善骨質疏松,研究表明:腦-腸-腸道菌群軸、腦-骨軸、腸-骨軸是調節骨代謝的主要機制〔21〕。本實驗表明:補充VitD和益生菌顯著增強大鼠骨密度,提升骨骼強度,改善骨小梁數量與形態,改變骨微結構,減少骨丟失,從而在一定程度上改善骨質疏松。Parvaneh等〔22〕的研究也表明補充雙歧桿菌可以導致骨小梁微結構改變,改變股骨微觀結構,促進骨形成,減少骨丟失。VitD3可以調節上消化道腸道微生物群,增強菌群豐度,從而保護胃腸道健康〔23〕。益生菌可以通過增加其在腸道中的數量及通過與其他細菌菌株競爭、分泌抗菌素來改變微生物群組成,且益生菌可以通過碳水化合物產生寡糖,寡糖進一步被細菌代謝,代謝物還可進一步改善微生物組成。擬桿菌門和厚壁菌門是腸道微生物群的兩大優勢菌群,對維持宿主新陳代謝有重要作用〔24〕,擬桿菌門參與碳水化合物發酵、糖類代謝和膽汁酸代謝等,厚壁菌門與擬桿菌門相似,能夠有效吸收熱量,是一類肥胖有關的菌群〔25〕。乳桿菌屬益生菌能夠抑制動物腸道病原菌生長,維持腸道菌群平衡,刺激和調節機體免疫應答,減少疾病發生〔26〕。本研究表明,VitD和益生菌改變腸道菌群數量與結構,使有益菌增加,同時增加腸道菌群豐度、均勻度與多樣性,進而在一定程度上改善骨代謝保護骨骼健康。為合理補充VitD和益生菌在預防骨質疏松發生發展提供了理論依據。