一株銅綠微囊藻溶藻真菌的分離鑒定及溶藻特性*

洪桂云 朱鈺妮 黃浚峰 朱曙光

(1.安徽建筑大學環境與能源工程學院,安徽 合肥 230601;2.建筑能效控制與評估教育部工程研究中心,安徽 合肥 230601)

近年來,全球氣候變暖和水體富營養化加劇導致藍藻水華在世界范圍內頻繁爆發,已成為全球性的水環境問題[1-2]。藍藻水華不僅破壞淡水生態系統的結構和功能[3],而且其代謝過程中還會產生大量有毒有害次生代謝物質,如藍藻毒素、惡臭氣體等,從而影響水產養殖業的發展和飲用水的安全[4-6]。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是常見的優勢藍藻水華藻種之一,太湖、巢湖、滇池曾多次爆發銅綠微囊藻水華,因此尋找高效經濟的防止藻類爆發的方法成為眼下人們重點關注的問題。

目前,國內外主要的藻類控制方法有物理法、化學法和生物法3大類。物理法能直接消除水中的藻類,且不產生二次污染,但成本高,難以大規模應用[7]。化學法工藝簡單,操作方便,但不能從根本上改善水質,且容易造成二次污染[8]。生物法因其經濟、高效、環境友好的特點逐漸成為控藻的主流方法[9-10]。自然界中有許多微生物對藻類具有抑制作用,包括放線菌[11]、真菌[12-13]、細菌[14]等。MOHAMED等[15]搜集了1960—2021年關于水華藍藻控制的文獻共145篇,其中關于細菌對藍藻生長影響的論文多達95篇,而關于真菌溶藻能力和溶藻方式的報道相對較少,目前只有15種真菌被鑒定為能夠抑制和裂解藍藻細胞。有研究發現,真菌對銅綠微囊藻的降解速率可能比細菌更快[16]。因此,本研究從富營養化水體及附近土壤中分離篩選出一株溶藻真菌,研究其溶藻特性、溶藻方式及溶藻效果,為利用溶藻真菌控藻提供更多實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 供試藻種

銅綠微囊藻購自中國科學院淡水藻種庫(FACHB),經活化后接種于BG11培養基,置于恒溫光照條件下培養,溫度設置為25 ℃,光照強度設置為2 000 lx,光暗比為12 h∶12 h,每天早中晚3次手動振蕩搖勻預培養7 d。

1.2 溶藻菌株的分離與鑒定

在安徽建筑大學校內兩個小池塘各取500 mL水樣,并在水樣采集地附近各取距地面10 cm處的潮濕土樣10 g。水樣采回后立即經0.8 μm濾膜粗過濾,再過0.45 μm纖維濾膜,然后把0.45 μm纖維濾膜剪成小份,投入150 mL液體察氏培養基中,30 ℃、150 r/min振蕩培養72 h。土樣取回后溶入500 mL蒸餾水中并在150 r/min下振蕩2 h,靜置,取10 mL上清液加入到150 mL液體察氏培養基中,30 ℃、150 r/min振蕩培養72 h。同時設空白對照組,為150 mL液體察氏培養基,30 ℃、150 r/min振蕩培養72 h。在培養后的5瓶菌液中各取10 mL,按體積比1∶9加入預培養后的銅綠微囊藻藻液中。取黃化藻液,平板劃線分離單菌落,在30 ℃下培養72 h后選20種形態、大小各異的單菌落,再進行復選,取最早使藻液黃化的溶藻真菌菌株JHQ3進一步研究。

用TaKaRa試劑盒提取溶藻真菌菌株脫氧核糖核酸(DNA)[17],采用瓊脂糖凝膠電泳分析所提取的DNA。以提取的DNA為模板,用真菌的ITS通用引物對真菌基因組進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增,其中上游引物為P1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’),下游引物為P2(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。擴增條件為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個循環;最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增得到的目的片段經瓊脂糖凝膠電泳分離后,在紫外燈下切割并收集長度為500 bp左右的片段,經Axygene膠回收試劑盒純化后測序。將測得的序列用DNAstar軟件編輯后,在美國國家生物信息中心(NCBI)數據庫中利用Blast軟件與GenBank中已知的ITS序列進行同源性比較,選取同源性較高的序列利用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹。

1.3 菌株JHQ3生長曲線的測定

采用干重法測定生長曲線。將菌株JHQ3接種于100 mL液體察氏培養基中制成菌懸液,150 r/min振蕩培養24 h,使菌懸液渾濁,取5 mL加入500 mL滅菌的液體察氏培養基,繼續150 r/min振蕩培養。每隔12 h取出10 mL用定量濾紙過濾,過濾前記錄濾紙質量,過濾后100～105 ℃烘干后再次稱量,過濾前后的質量差為菌體干重。繪制以時間為橫坐標,菌體干重為縱坐標的曲線,即為菌株JHQ3的生長曲線。結果表明,JHQ3在0～4 h處于停滯期,4～36 h處于對數期,36～72 h處于穩定期,72 h后進入衰亡期。處于穩定期時真菌生物量最大,故后續選取穩定期菌液作為原菌液進行溶藻實驗。

1.4 菌株JHQ3溶藻方式探究

對分離得到的菌株JHQ3原菌液采取3種方式處理:10 000 r/min離心10 min,得到上清液a;移走上清液后的離心渣用滅菌后的液體察氏培養基定容至5 mL,使菌體重新懸浮,得到菌懸液b;不作處理為原菌液c。分別將上清液a、菌懸液b和原菌液c按體積比1∶99接種至預培養后的銅綠微囊藻藻液中進行溶藻實驗。空白對照組不加菌液,用相同體積的BG-11培養基代替。6 d后采用超聲輔助熱乙醇提取/分光光度法測定葉綠素a,并按式(1)計算溶藻率。

1.5 菌株JHQ3的溶藻特性研究

1.5.1 菌液濃度對溶藻效果的影響

將原菌液分別稀釋至100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,按體積比1∶99分別接種至預培養后的銅綠微囊藻藻液中進行溶藻實驗,并設置對照組不加菌液(下同),6 d后測定葉綠素a并計算溶藻率。

(1)

1.5.2 光照時間對溶藻效果的影響

將原菌液按體積比1∶99接種至預培養后的銅綠微囊藻藻液中進行溶藻實驗,光暗比考察了12 h∶12 h和24 h∶0 h兩組,分別設了對照組,6 d后測定葉綠素a并計算溶藻率。

1.5.3 培養溫度對溶藻效果的影響

將原菌液按體積比1∶99接種至預培養后的銅綠微囊藻藻液中進行溶藻實驗。培養溫度考察了20、25、30 ℃,并分別設置對照組,6 d后測定葉綠素a并計算溶藻率。

1.5.4 pH對溶藻效果的影響

將液體察氏培養基pH分別調整為5、6、7、8、9,將原菌液按體積比1∶99接種至預培養后的銅綠微囊藻藻液中進行溶藻實驗,并分別設置對照組,6 d后測定葉綠素a并計算溶藻率。

1.5.5 添加表面活性劑對溶藻效果的影響

將1 mL原菌液轉接到100 mL液體察氏培養基中,30 ℃、160 r/min振蕩培養24 h,分別加入1 mL質量分數0.05%的乙二胺四乙酸(EDTA)和Tween-80,繼續振蕩培養2 d,將此時的原菌液按體積比1∶99接種至預培養后的銅綠微囊藻藻液中進行溶藻實驗,并設置對照組,6 d后測定葉綠素a并計算溶藻率。

2 結果與分析

2.1 溶藻菌株的分離與鑒定結果

將PCR擴增JHQ3產物與NCBI數據庫比對,構建系統發育樹(見圖1),發現菌株JHQ3與AspergillussydowiiMEF105(KT315450)聚于一枝,因此鑒定菌株JHQ3為薩氏曲霉菌屬(Aspergillussydowii)。

圖1 菌株JHQ3的系統發育樹

2.2 溶藻菌株JHQ3的溶藻方式

由圖2可見,原菌液c和菌懸液b的溶藻效果好,溶藻率分別達到98.21%、91.07%,不過上清液a也可通過釋放的胞外物質達到溶藻效果,其溶藻率為71.43%。由此說明,該溶藻菌株主要通過自身直接裂解藻細胞溶藻,也通過分泌胞外活性物質溶藻[18],故可判斷溶藻菌株JHQ3的溶藻方式是直接溶藻和間接溶藻并存,且以直接溶藻方式為主[19]。

圖2 溶藻菌株JHQ3的溶藻方式探究

2.3 菌株JHQ3的溶藻特性

2.3.1 菌液濃度對銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖3可見,原菌液(菌液濃度100)溶藻率最高,達到97.56%,稀釋至10-1、10-2、10-3的菌液溶藻率分別為92.68%、85.37%、12.20%,菌液濃度稀釋至10-3以下,溶藻效果較差。菌液濃度是反映細菌密度的重要參數。洪桂云等[20]研究細菌不同菌液濃度對銅綠微囊藻的去除效果也表明,菌液濃度越高,溶藻效果越好,與本研究結論一致。

圖3 不同菌液濃度的溶藻效果

2.3.2 光照時間對銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖4可見,在光暗比為12 h∶12 h時溶藻效率高于24 h∶0 h時,說明接近自然光照條件能夠使溶藻菌起到更好的溶藻效果,有利于實際應用。

圖4 不同光照時間的溶藻效果

2.3.3 培養溫度對銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖5可見,在30 ℃培養溫度下,溶藻率為94.06%,溶藻效果較好,25、20 ℃培養溫度下,溶藻率分別為81.44%、61.06%,這是因為薩氏曲霉菌屬的適宜生長溫度為30～37 ℃,因此實際應用溶藻菌JHQ3控藻時,溫度宜控制在30 ℃以上。

2.3.4 pH對銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖6可見,pH為7時溶藻效果最優,溶藻率達83.39%;pH為9時溶藻效果最差,溶藻率只有50.00%,說明溶藻菌株JHQ3在堿性條件下會受到較大抑制,能耐一定的酸性,但在中性條件下對銅綠微囊藻的溶藻效果最好。朱葉飛等[21]、劉茜[22]得出pH為6時溶藻效果最好,袁軻婷等[23]得出pH為8時溶藻效果最好,與本研究比較接近。

圖6 不同pH的溶藻效果

2.3.5 添加表面活性劑對銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖7可見,與對照組相比,添加表面活性劑Tween-80或EDTA均會抑制JHQ3溶藻,而且添加EDTA的抑制效果比添加Tween-80更為明顯。

圖7 添加表面活性劑的溶藻效果

3 結 論

(1) 從校園環境中篩選到溶藻效果較好的溶藻真菌菌株JHQ3。通過ITS序列分析,初步鑒定菌株JHQ3為薩氏曲霉菌屬。

(2) 溶藻菌株JHQ3的溶藻方式研究表明,該菌株溶藻方式以直接溶藻為主,間接溶藻為輔。

(3) 溶藻菌株JHQ3原菌液的溶藻率最高可達97.56%,該菌株在30 ℃下溶藻效果最好,溶藻率可以達到94.06%,pH為7時溶藻效果達83.39%,光暗比12 h∶12 h時溶藻效果較好,表面活性劑對溶藻真菌JHQ3有一定的抑制作用,EDTA的抑制作用要大于Tween-80的抑制作用。