牛冠狀病毒TaqMan熒光定量檢測方法的建立及國內部分地區流行病學調查

黃金　李思遠　謝玲玲　周迪　楊蓉　王松　周華　蔡旭航　李基棕　李彬

摘要：牛冠狀病毒（BCoV）在全球廣泛存在，在臨床上能引起牛腹瀉以及呼吸道感染，給養殖業帶來巨大經濟損失。為快速批量檢測臨床樣品、分析國內的BCoV隱性感染及流行情況，根據BCoV的N基因序列設計了引物和探針，建立了TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，對其特異性、敏感性、重復性進行評估，并將其與靶向BCoV的N基因的常規RT-PCR方法進行對比。利用本方法對采集自我國西藏、江蘇、河北、貴州、安徽等5個省份的22個未發病牛場的35份口腔拭子樣品和244份糞便樣品進行檢測以了解流行情況。結果表明，質粒標準品拷貝數的對數與CT值呈現良好穩定的負線性關系，標準曲線為y=-3.441 8x+39.584 0，r2=0.999 4，E=98.2%；最低檢測拷貝數為6.0×10拷貝/μL，重復性變異系數均<5%；對臨床樣品進行檢測，檢出率明顯高于常規RT-PCR方法。對22個牛場的279份病料進行檢測，結果顯示BCoV的總體陽性率為73.12%，牛場陽性率為100.00%。本研究成功建立了靶向BCoV N基因、靈敏度高、特異性好的熒光定量RT-PCR檢測方法，并初步掌握了我國5個省份BCoV的流行現狀，為后續BCoV研究奠定了基礎。

關鍵詞：牛冠狀病毒；TaqMan熒光定量；樣品檢測；隱性感染；RT-PCR

中圖分類號：S852.65+3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2023）17-0029-05

牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）隸屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，為有囊膜的基因組為線性單股正鏈的RNA病毒［1］，臨床上常引起犢牛出血性腹瀉、成年牛冬季痢疾和呼吸道疾病。該病毒在世界范圍內廣泛存在，除感染牛以外，也可以感染野生反芻動物，如羊駝、麋鹿等。1988年，研究人員從德國1名兒童腹瀉樣品中分離出1株與BCoV基因組關系密切的毒株，提示BCoV存在跨物種傳播的可能［2］。BCoV已嚴重影響病畜的生長發育和養牛業的健康發展，給養牛業造成了巨大的經濟損失。

不同病原引起犢牛腹瀉在臨床和病理變化上極為相似，而利用PCR技術進行檢測具有靈敏性高、特異性強、快速簡單等優點，在病原診斷和流行病調查方面具有十分重要的地位。BCoV的全基因組大小約為32 kb，能編碼5種主要結構蛋白，而其中高度保守的N基因序列常常被作為診斷BCoV病的靶向基因［3］。在此理論基礎上，本研究以N蛋白核苷酸序列為靶向，建立了檢測BCoV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，能夠實現特異、靈敏、快速批量檢測臨床樣品，便于開展BCoV的流行病學調查；本研究對我國5個省份的22個BCoV未發病牛場共279份牛樣品進行篩查，旨在了解我國不同地區BCoV的流行感染情況，為我國部分地區的流行病學調查提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 病料、菌株及臨床樣品

BCoV病料、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV）、牛星狀病毒（bovine astrovirus，BAstV）、牛副流感病毒（bovine parainfluenza virus，BPIV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛腺病毒（bovine adenovirus，BAV）、牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛源大腸桿菌K99、牛源產氣莢膜梭菌的核酸樣品，均由江蘇省農業科學院獸醫所實驗室保存。

用于臨床樣品檢測的樣品：279份樣品，2021年2月至2022年7月采集自西藏、江蘇、河北、貴州、安徽各地的22個牧場，其中，河北7個牧場56份，西藏9個牧場94份，江蘇4個牧場66份，貴州1個牧場31份，安徽1個牧場32份。所有樣品均于江蘇省農業科學院獸醫所實驗室-80? ℃保存。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、HiScriptⅡ RT SuperMix for qPCR、2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）、AceQ qPCR Probe Master Mix等，均購自Vazyme公司；質粒提取試劑盒、膠回收提取試劑盒，購自Omega Bio-Tek公司；pMD19-T載體，購自TaKaRa公司；DNA Marker購自南京擎科生物科技有限公司。

1.3 引物合成

根據BCoV（GenBank，MW711303.1）N蛋白核苷酸序列，選擇N基因保守區域設計TaqMan法的特異性檢測引物（BCoV-F，BCoV-R）和探針及構建質粒標準品的引物（N-F，N-R），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表1。

1.4 標準品的構建與鑒定

2021年2月，通過臨床樣品檢測鑒定得到BCoV陽性病料。對BCoV陽性病料進行處理后，采用RNA提取試劑盒獲取RNA，反轉錄為cDNA，以其為模板，采用引物N-F、N-R進行PCR擴增；獲得PCR產物跑核酸膠，膠回收后連接至pMD19-T載體；轉化Trans5α、挑菌、提質粒，經常規PCR鑒定后，將陽性質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序正確的BCoV重組質粒作為標準品，測濃度，計算拷貝數。

1.5 優化反應體系及條件

20.0 μL反應體系（Mix 10.0 μL，探針0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，染料0.4 μL，模板2.0 μL，ddH2O 6.6 μL），優化退火溫度Tm（55～65 ℃），通過分析CT值和擴增曲線，確定最佳Tm；再以優化的最佳Tm對濃度為10 μmol/L的引物用量（0.2～1.2 μL）及 10 μmol/L的探針用量（0.1～1.0 μL）進行優化。

1.6 標準曲線的建立

將標準品稀釋101～1012倍后作為檢測模板，采用TaqMan熒光定量RT-PCR方法檢測，獲得拷貝數與CT值的線性關系，從而建立標準曲線。

1.7 特異性檢驗

以BCoV、BVDV、BRV、BAstV、BPIV、IBRV、BAV、BRSV、牛源大腸桿菌K99、牛源產氣莢膜梭菌的cDNA/DNA為模板，以標準品（6.0×103拷貝/μL）為陽性對照，ddH2O為陰性對照加以擴增。

1.8 敏感性檢驗

將稀釋的標準品作為模板，ddH2O為陰性對照擴增，每個稀釋度做3次重復，與常規RT-PCR進行比較。

1.9 重復性檢驗

對6×104、6×106、6×108拷貝/μL稀釋度的標準品進行批內重復性試驗，每個檢測濃度設置3次重復，分3個時間段。

1.10 樣品檢測

在35份牛口腔拭子樣品中加入500 μL已滅菌的PBS，渦旋，4 ℃ 12 000 r/min離心3 min后，取病毒上清液200 μL加入400 μL的RL裂解，獲得總RNA，反轉錄為cDNA；244份牛糞樣品各取1 g加500 μL已滅菌的PBS充分渦旋，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，步驟同上。以獲得的cDNA為模板，利用建立的TaqMan法進行BCoV檢測，選10%陽性PCR產物送公司測序。

1.11 2種RT-PCR符合率的比較試驗

將35份牛口腔拭子和244份牛糞便樣品的cDNA分別用建立的熒光定量方法和常規RT-PCR分別檢測，比較檢測結果，同時送去測序，計算2種方法的符合率。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的鑒定

以病料BCoV的cDNA為模板，利用引物 N-F/R 進行PCR擴增，樣品跑膠后獲得N基因片段全長，大小約為1 300 bp（圖1）；切膠回收連于 pMD-19T 載體，轉化入Trans5α，挑菌、搖菌提質粒鑒定，陽性質粒送測序，結果在NCBI上與BCoV其他株比對，同源性為100.00%，說明重組質粒構建成功。測得濃度為263.47 ng/μL，相應的拷貝數為 6.0×1012 拷貝/μL。

2.2 反應條件的優化結果

最佳反應體系及條件如下：AceQ qPCR Probe Master Mix 10.0 μL，探針0.2 μL，上下游引物各 0.4 μL（10 μmol/L），染料0.4 μL，模板2.0 μL，ddH2O 6.6 μL。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

2.3 擴增曲線和標準曲線的建立

將稀釋成6×10～6×1012 拷貝/μL 的標準品分別作為模板擴增，獲得曲線。由圖2可知，標準品在6×10～6×108拷貝/μL與CT值呈現良好的負線性關系，得到標準曲線y=-3.441 8x+39.584 0，r2=0.999 4，擴增效率（E）為98.2%。

2.4 特異性檢驗結果

采用該方法對BCoV標準品及牛常見腹瀉病原的核酸進行檢測，結果（圖3）表明，BCoV的標準品擴增結果為陽性，其他病原的核酸擴增結果均為陰性，表明該方法的特異性較強。

2.5 敏感性檢驗結果

采用該方法對經過10倍比稀釋的標準品（6×10～6×1012拷貝/μL）進行擴增，并設置ddH2O為陰性對照。由圖4可知，本方法對重組質粒標準品的最低檢出拷貝數為6.0×10拷貝/μL，對應CT值約為36，敏感性為6.0×10拷貝/μL，與文獻報道的檢測下限［4］幾乎相同；RT-PCR的最低檢出拷貝數為6.0×103 拷貝/μL，表明該熒光定量方法敏感性更高。

2.6 重復性檢驗結果

在不同時間段用3個不同稀釋度的標準品分別進行重復性試驗，結果（表2）表明，該方法的批內和批間的變異系數均低于5%，具有良好的重復性。

2.7 常規RT-PCR和TaqMan法熒光定量 RT-PCR 檢測方法的比較

由表3可知，常規RT-PCR對牛口腔拭子樣品（n=35）和牛糞樣品（n=244）的檢出率分別為80.00%和34.01%，TaqMan法熒光定量RT-PCR檢測方法則為91.42%和70.49%；2種方法檢測牛口腔拭子的陽性符合率為87.50%，檢測牛糞樣品的陽性符合率為48.25%。測序結果經比對后發現，熒光定量方法判定為陽性的均為BCoV片段，表明本研究建立的方法準確性相對更高。

2.8 臨床樣品的檢測結果

本次試驗共檢測279份樣品，包括牛口腔拭子樣品35份，牛糞便樣品244份。由表4可知，BCoV的總檢出率為73.12%，牛場陽性率為100.00%。為驗證本次試驗檢測數據的真實可靠性，隨機選取判定為陽性的樣品進行測序驗證，結果與預期相符，表明此方法可行。

3 討論與結論

BCoV是引起牛消化道和呼吸道疾病的主要病原之一。1972年，美國的Mebus等曾在牛的腹瀉病料中檢出BCoV病原，此后在世界各地均陸續大量報道了該病的發生［5］。1985年，宋廣林等首次報道了BCoV在我國大陸的存在情況［6］，隨后在我國各省多次成功檢出BCoV，陽性率高達70%，說明此病毒已在我國長期持續存在。但目前尚未研發出有效的疫苗及藥物，因此，早期采取合理有效的疫病監測手段，及時淘汰陽性牛、隱形感染牛，是減少畜牧養殖業經濟損失，遏制疾病傳播的有效方法。

目前，國內外檢測BCoV的方法有很多種，而實時熒光定量PCR檢測速度快、敏感性好、特異性強、重復性強、準確率高，適用于大量樣本的快速檢測。國內外有些學者先后建立了BCoV的RT-PCR［7］、染料法熒光定量PCR［8-9］，而TaqMan法比其特異性更高。譚爍等以nsp10為靶向，建立了BCoV檢測方法，與國外利用M基因方法進行比較，發現結果存在偏差，研究發現存在偏差的可能原因是M基因變異［4］。因此，本研究選擇了BCoV保守的基因N為靶向設計引物和探針，避免傳統檢測方法中因為基因突變所產生的假陰性結果。本試驗將重組質粒進行10倍比稀釋作為標準品，獲得標準曲線 y=-3.441 8x+39.584 0，r2=0.999 4，E=98.2%，表明所建立的方法擴增效率高，重復性強；檢測實驗室保存的常見腹瀉病原的核酸，結果表明建立的檢測方法能準確檢測出BCoV，不產生交叉干擾；同時本試驗的檢測方法最低可檢測到6×10拷貝/μL的核酸模板，與高輝等建立的熒光定量檢測方法靈敏度在一個數量級上［10］。采用建立的檢測方法，對5個省份的22個未發病牧場進行流行病學調查，采用常規RT-PCR進行同步檢測，檢測結果基本相符并且熒光定量檢出的陽性數量多于常規RT-PCR，表明所建立的方法具有更高的靈敏性和準確性。

對5個省份22家牧場未發病的樣品進行檢測，牛場陽性率高達100%，說明我國牛場BCoV的感染率很高，BCoV廣泛存在于牛場，但是常表現為不發病的隱性感染，潛伏性很強，通過臨床表現觀察不能檢出。同時，有研究表明，BCoV導致牛群的發病與環境有很大關系，牛群的群體抵抗力下降（如環境不良等），易發生BCoV病［11］，提示或許是我國牛場養殖不規范不合理，生物安全防控不到位，導致我國牛場感染率過高。在5個省份牛場對BCoV病原的檢測中，5個省份的檢出率從6.25%～96.97%不等，5個省份的陽性檢出率差別大。其中，江蘇、西藏的感染率高，河北、貴州次之，安徽的感染率最低，這與劉蓉菁等的結果［12］一致。江蘇、西藏、河北的感染率均高于50%，提示該地區導致牛腹瀉的主要病原很可能是BCoV，需要引起高度重視；西藏、江蘇的陽性率高于90%，推測兩省對于BCoV的生物安全防控不是特別到位，導致BCoV在各省內大范圍傳播；西藏地區主要為牦牛，推測牦牛與普通牛相比更易感BCoV；或是牦牛的飼養方式與其他省份不同，牦牛的主要飼養方式是放牧，更容易導致病原的傳播；或者西藏地區是否進化出使牦牛易感的特殊BCoV株；安徽省在此次檢測中檢出BCoV，與楊海峰等的研究結果［12］不一致，表明BCoV在我國的傳染范圍變大且持續存在。BCoV是感染消化道和呼吸道的病原，因此本次研究統一采用檢測口腔拭子和牛糞便的方法，結果表明口腔拭子的檢出率明顯高于牛糞便，呼吸道型BCoV明顯高于腹瀉型BCoV，這與高輝等的調查結果［10］是一致的，推測可能是呼吸道BCoV引發的呼吸道疾病綜合征［13-14］在臨床上的表現癥狀輕，不易察覺；其次，本次結果提示在我國BCoV引起呼吸道感染的癥狀多于腹瀉癥狀，但是由于本次口腔拭子樣品有限，還需進一步檢測研究。

本研究建立了一種以BCoV保守的N基因為靶向的TaqMan熒光定量方法，能夠快速、特異、靈敏地檢出BCoV的核酸；運用此檢測方法對我國5省22個牧場進行流行病學調查，結果表明我國5省的BCoV總陽性率為73.12%，牛場陽性率高達100.00%。

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收稿日期：2022-11-11

資助項目：國家重點研發計劃（編號：2021YFD1801101）；江蘇省自然科學基金（編號：BK20221432）。

作者簡介：黃 金（1999—），女，江西省贛州市人，碩士研究生，從事動物傳染病防治和診斷技術研究。E-mail：1748916481@qq.com。

通信作者：李基棕，博士，副研究員，從事家畜重要疫病的病原學、致病機制與免疫防控技術研究，E-mail：lijizong22@sina.com；李 彬，博士，研究員，從事動物腹瀉病防控技術、重要豬病感染與免疫的分子機制、新型疫苗和診斷試劑開發等研究，E-mail：libinana@126.com。