維生素C工業廢棄液對新疆鹽堿土中棉花種子萌發的影響

韓曉　高明夫　徐慧

摘要：古龍酸母液（RAE）和巨大芽孢桿菌廢液（CBS）是維生素C工業生產過程中產生的液體廢棄物。采用鹽堿性土壤棉花盆栽試驗，通過CBS包被棉花種子并施澆RAE稀釋液，以評估維生素C發酵工業廢棄物對棉花種子萌發的影響以及在農業上的資源化利用潛力。結果表明，CBS包被種子、施加稀釋50倍RAE或兩者聯合使用均可以明顯提高種子萌發率，促進根的伸長和鮮質量的增加，且兩者聯合使用效果更好。一方面，兩者聯合使用可增加土壤有機碳含量并在發芽期使土壤pH值從8.2降低至6.5，為種子萌發提供更有利的外部環境條件，使種子發芽率、發芽指數、活力指數分別提高了37.49%、54.55%和44.09%。另一方面，通過提高L-古洛糖酸-1，4-內酯氧化酶基因表達水平，根部維生素C含量提高87.73%，增強了種子在發芽期的非生物脅迫抗性，促進根的生長（10 d時的根長和鮮質量分別增加19.33%和49.64%）；與棉花根細胞壁形成相關的內切幾丁質酶基因（ECA）和木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶基因（XTH）的表達在多數試驗時期明顯上調，也表明了根部發育更活躍。通過CBS包被棉花種子和施加RAE影響鹽堿土中棉花種子萌發的試驗研究，為資源化利用維生素C工業廢棄液并開發出一種鹽堿土棉花種植新技術提供了理論依據。

關鍵詞：維生素C工業廢棄液；鹽堿土；有機質；棉花；萌發；鹽脅迫

中圖分類號：Q564；S562.01文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2023）17-0105-06

棉花是我國主要經濟作物之一。據國家統計局統計，2021年新疆棉花產量達512.9萬t，占全國棉花總產量的89.5%。得益于新疆獨特的光熱條件，新疆棉花擁有較高的品質優勢，是新疆農業支柱性經濟產業［1］。作為一種耐鹽作物，棉花可以較好地適應鹽堿土環境，也是鹽漬土地區經濟發展的主要先鋒作物。但棉花種子在萌發出苗階段對土壤鹽堿度敏感，在此期間遭受鹽堿脅迫會抑制種子活力［2］。堿性鹽脅迫的危害遠大于中性鹽脅迫，鹽堿脅迫導致植物細胞質膜被破壞，代謝紊亂，阻礙植物的生長發育［3］。隨著鹽堿濃度的增加，種子發芽率、胚芽長度等均有降低的趨勢［4］，影響植物種子萌發過程中內部物質轉化，降低酶活性，抑制種子萌發［5］，最終導致棉花發芽率低、幼苗瘦弱、減產等后果［6-7］。作物出苗是保證作物產量的首要前提，由于棉花播種萌發過程中會受到土壤酸堿度、鹽分含量、種子質量等因素的影響，導致棉花萌發狀況和出苗率參差不齊，進而影響棉花種植密度和產量，所以提高棉花萌發率與出苗率對提高棉花產量具有重要的現實意義［8］。有研究表明，適宜濃度的蘋果酸可緩解銅脅迫對珊瑚櫻種子萌發的抑制作用，提高種子發芽指數和活力指數，增強幼苗脅迫抵抗能力［9］。檸檬酸或低濃度阿魏酸和香豆酸可促進甜瓜種子發芽［10］。楊洪兵的研究表明，適宜濃度的外源蘋果酸和檸檬酸對鹽脅迫具有較好的緩解作用，對鹽脅迫下蕎麥種子發芽率、活力指數及幼苗生長有明顯的促進效應［11］。此外，具有解磷功能的芽孢桿菌也可促進種子萌發和胚軸伸長［12］。

古龍酸母液（RAE）是工業上通過二步微生物發酵法生產維生素C前體化合物（2-酮基-L-古龍酸，簡稱2KGA）過程中產生的酸性廢液，其主要成分是2KGA、甲酸、草酸混合物。我國是世界上最大的維生素C（VC）生產和供應國，每年排放約5萬t廢棄RAE和12萬t巨大芽孢桿菌廢液（CBS）［13］。筆者推測含有低分子量有機酸的RAE和含有巨大芽孢桿菌的CBS具有促進鹽堿條件下作物種子萌發的潛力。本研究采用CBS對棉花種子進行包被，同時聯合沖施RAE稀釋液，探究二者對新疆鹽堿土中棉花種子萌發過程以及關鍵基因表達和代謝物等因素的影響，以期為RAE和CBS的資源化利用提供理論基礎，同時提供一種具有應用潛力的促鹽堿土中棉花種子萌發的新技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年7月1—30日在中國科學院沈陽應用生態研究所環境微生物組實驗室進行。試驗土壤取自新疆阿克蘇地區庫車市棉花種植區，土壤pH值為8.26，含水量為7.3%，土壤有機碳、全氮含量分別為12.44、0.67 g/kg，土壤銨態氮、硝態氮、有效磷的含量分別為15.78、8.74、22.07 mg/kg。試驗所用棉花種子為陸地棉種子。

1.2 盆栽試驗

共設計4個試驗組，每組設3次重復。對照組（CK）：水包被+水施澆；處理組1（RAE）：水包被+稀釋50倍RAE施澆；處理組2（CBS）：CBS包被+水施澆；處理組3（RC）：CBS包被+稀釋50倍RAE施澆。包被處理：種子在CBS液中浸濕后取出，分散在培養皿中，置于通風處24 h至干燥。重復上述步驟1次，即共包被2次。

RAE和RC處理施澆稀釋50倍RAE后鋪種覆土，CK和CBS處理施加等量清水后鋪種覆土，每盆150顆種子。每天對已發芽的種子（芽長超過種子長度1/2）進行計數和測量根長度，直到連續3 d沒有新的種子萌發為止，并測定土壤的pH值變化。

1.3 種子發芽參數

總發芽率（GP）指測試種子發芽數占測試種子總數的比例。

GP=（n/N）×100%。

式中：n為最終發芽的種子數；N為試驗種子數。

發芽速率（GR）計算公式如下：

式中：GPt為第t天（t=1，2，3，…）的發芽率；Dt為相應的發芽時間，d。

發芽指數（GI）指種子發芽數與發芽需要天數之比。

式中：Gt為當天的發芽數（t=1，2，3，…）；Dt為相應的發芽時間，d。

活力指數（VI）是種子發芽速率和生長量的綜合反映，是種子活力的更好指標。

式中：Lr為發芽種子的平均根長度，mm。

1.4 土壤有機碳含量、pH值及植物維生素C含量的測定

土壤pH值采用電位法［14］測定。稱取過2 mm孔徑篩的風干土樣5 g至燒杯中，加入12.5 mL去除CO2的蒸餾水，攪拌1～2 min，25 ℃下，搖床振蕩 30 min 后進行測定。檢測電極插入待測液中，靜置片刻，待讀數穩定后記下pH值。

有機碳含量的測定采用元素分析儀測定法［15］。土壤風干后，用1 mol/L鹽酸去除HCO-3/CO2-3，再次風干后用研缽研磨并過孔徑為0.05 mm的土壤篩，稱取50 mg土壤樣品，并用錫箔紙包裹好，利用元素分析儀（multi N/C 3100，德國耶拿分析儀器股份公司）測定有機碳含量。

植物維生素C含量的測定參考Gao等的方法［16］，采用高效液相色譜法。測定樣品取自栽培10 d時收集的棉花根系。在液氮速凍下研磨樣品，在冰浴條件下，將其溶于2 mL的10 mg/mL偏磷酸中。在 4 ℃ 條件下，勻漿離心（轉速7 200 g） 10 min，上清液用注射過濾器（0.22 μm）過濾后，將20 μL濾液注入AQ-C18色譜柱中進行分析。檢測條件：流動相，20 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（pH值2.8） ∶乙腈=95 ∶5；流速為1.0 mL/min；溫度為 40 ℃；檢測波長為 243 nm。根據維生素C標準曲線確定樣品中維生素C的含量。

1.5 細胞壁和維生素C代謝酶基因表達量測定

選取5個與植物細胞壁合成以及維生素C代謝相關的基因，分別是內切幾丁質酶基因（ECA）、ω-羥基棕櫚酸O-阿魏酰轉移酶基因（HFT）、果膠甲酯酶6基因（PME6）、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶基因（XTH）和L-古洛糖酸-1，4-內酯氧化酶基因（GLO）進行相對基因表達量測定。

相對基因表達量測定方法：實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法。稱取80～100 mg棉花根系樣品，液氮速凍后研磨至無明顯組織碎片，總RNA的提取按照SteadyPure Universal RNA Extraction Kit ［Accurate Biotechnology （Human） co.，Ltd］說明執行。cDNA的制備按照EvoM-MLV RT Premix ［Accurate Biotechnology （Human） co.，Ltd］說明執行，10 μL反應體系中，總RNA量不超過500 ng。RT-qPCR反應體系按照SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit ［Accurate Biotechnology （Human） co.，Ltd］說明執行，檢測平臺為Rotor-Gene 3000，在 20 μL 的反應體系里，cDNA模板量不超過 100 ng，引物見表1。程序設定：熱啟動95 ℃，5 min，1個循環；變性 95 ℃，15 s；退火60 ℃，35 s；延伸72 ℃，45 s，45個循環，基因相對表達量采用2-ΔΔCT算法計算。

1.6 數據分析

采用Microsoft Excel 2020軟件進行數據處理，用SPSS 21.0軟件在0.05水平上對數據進行方差分析，檢驗處理組與對照組差異的顯著性，采用Graphpad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 棉花種子發芽率的日變化

由圖1可知，各組棉花種子的累積發芽率在孵育9 d時趨于平穩，其中CK在孵育9 d時累積發芽率為51.56%。各處理棉花種子萌發9 d內的累計發芽率均明顯高于CK。RAE處理的發芽率較CK提高7.11百分點，CBS處理的發芽率較CK提高14.66百分點，RC處理的發芽率較CK提高19.33百分點。上述結果表明，RAE和CBS聯合使用（RC處理）對棉花種子發芽率的提升效果最好。

2.2 種子萌發各參數的變化

由表2可知，各處理組的種子萌發相關參數，即總發芽率（GP）、發芽速率（GR）、發芽指數（GI）與CK相比均有極顯著增加（P<0.01），尤其是RAE與CBS聯合使用的RC處理分別使上述參數提高了37.49%、54.55%、44.09%。活力指數（VI）是體現種子萌發活力的主要參數，施加稀釋50倍RAE、CBS包被種子單獨使用或稀釋50倍RAE與CBS包被種子聯合使用對VI都有極顯著影響，稀釋50倍RAE與CBS包被種子聯合使用使VI提高了87.05%，表明兩者聯合使用可以極顯著促進棉花種子萌發。

2.3 RAE與CBS對種子萌發后根生長的影響

由圖2可知，3種不同處理均可促進棉種發芽后根的生長。4 d時，相較于CK，RAE、CBS、RC處理的根部長度分別增加32.08%、34.54%、54.43%；6 d時，根長分別顯著或極顯著增加32.08%、52.40%、48.03%；10 d時，RAE處理與CK無顯著差異，而CBS處理和RC處理分別極顯著增加13.76%和19.33%。

不同處理對根部鮮質量的影響與對根長度的影響趨勢大體相同，RAE、CBS、RC處理均能增加根鮮質量，且RC處理效果最好。在整個試驗周期內，各處理組種子發芽后，根鮮質量均有增加。4 d時，3種處理的根鮮質量分別增加4.39%、28.69%和31.61%；6 d時，根鮮質量分別增加38.44%、36.45%和85.75%；10 d時，根鮮質量分別顯著或極顯著增加18.55%、25.95%和49.64%，依然是RC處理效果最好。

2.4 細胞壁合成相關基因表達變化

由圖3可知，4個細胞壁合成相關基因的表達水平在不同時期變化有所不同。相比于CK，RAE處理能顯著或極顯著提高HFT和XTH基因的表達，并維持在較高的表達水平。在試驗中期（6 d時），觀察到CBS處理的4個基因的表達水平均提高。RC處理的ECA和XTH表達量則處于較高水平（6 d 時的XTH表達量除外）。

2.5 GLO表達水平對維生素C代謝的影響

L-古洛糖酸-1，4-內酯氧化酶（GLO）是植物維生素C合成途徑中的關鍵酶之一，維生素C的積累與GLO的表達水平密切相關。由圖4可知，在試驗前期（4 d時），RAE處理的GLO表達水平較CK極顯著提升，但之后出現下調。在不同時間點，CBS處理的GLO表達水平一直高于CK。而RC處理同樣能夠促使GLO維持在較高的表達水平， 并且在中期（6 d時）高于CBS處理。同時，各處理組根部10 d時的維生素C含量均顯著或極顯著高于CK，其中，RC處理對維生素C積累的促進效果最好，根部維生素C含量較CK提高87.73%。

2.6 土壤有機碳含量與pH值變化

新疆庫車市棉花種植區土壤pH值為8.26，接近重度堿性（pH值為8.5），堿性環境是種子萌發的關鍵限制因素之一。從圖5可以看出，施澆RAE（RAE和RC處理）促進了土壤有機碳的積累，并且土壤pH值最低降至6.5。可見，RAE在一段時間內可以為種子萌發提供較適宜的酸堿環境，并為提高土壤水溶性有機碳含量做出重要貢獻，提供了相對有利的種子萌發環境。

3 討論與結論

維生素C發酵工業所產生的廢棄RAE和CBS排放量大、化學需氧量（COD）高，一直以來被作為廢水進行處理，造成嚴重的資源浪費和環保壓力。因而，探索其可能被資源化再利用的新途徑是一項迫切需求。筆者所在團隊的近期研究表明，二者的施用可以增加土壤有機質含量，并提高作物維生素C含量，進而提高作物在鹽堿土壤上的產量［17］，并且2KGA作為RAE的主要成分能解除鹽脅迫對作物生長的抑制作用已被證實［16］，但二者對作物種子萌發，尤其是在鹽堿性土壤中對棉種萌發的影響尚不清楚。

本研究中，施澆RAE或CBS包被棉花種子均能提高種子的發芽率、發芽指數、活力指數等發芽參數，促進了棉花種子的萌發，并且二者聯合使用的效果更好。已有研究表明，種子從萌發到幼苗期對鹽堿脅迫十分敏感［18-19］。有報道認為，利用秸稈等生物炭或有機酸可以提高土壤有機碳含量，改良鹽堿化土壤，有機酸還可以降低土壤pH值，并緩解鹽脅迫對植物的危害［20-21］。本試驗中，RAE和CBS聯合施用情況下，一方面，RAE中的2KGA作為一種低分子量有機酸可以提高土壤有機質含量、豐富土壤微生物種群［22］，降低堿性土壤的pH值；另一方面，CBS中的主要微生物為巨大芽孢桿菌，該菌具有解磷功能，并在土壤中存在明顯的根際效應［23］，促進固態磷轉化為可供植物利用的有效磷，增加土壤養分和有益菌豐度，抑制病原菌屬［24］，同時可促進種子萌發［25］。因此，二者的聯合使用為棉花種子在鹽堿土中的萌發提供了更有利的土壤環境，進而提高了種子發芽率。

本研究發現，RAE和CBS處理后均能促進棉種發芽后根部長度和鮮質量的增加，且兩者聯合使用的作用效果更好。Gao等研究發現，2KGA能促進GLO表達量增加，并提高維生素 C 含量，有效緩解鹽脅迫的抑制作用，并促進植物幼苗和側根的生長［16］。在植物中，GLO（EC 1.1.3.8）催化L-古洛糖酸-1，4-內酯向維生素C的轉化。本研究中，澆施富含2KGA的RAE時，棉花根系GLO基因表達在短時間內快速上調，并且根部的維生素C含量升高，筆者推測這是強化非生物脅迫抗性的主要原因。Aghaei等也指出，增強內源維生素C含量可以促進根的發育，同時能夠改善植物的能量代謝［26］，進而促進植物的生長［27］。此外，有研究指出，芽孢桿菌通過對根分泌物的趨化作用調控根際細菌群落，提高植物維生素C含量［28］，為促進根系發育創造了條件。因此，RAE和CBS處理提高根部維生素C積累是促進胚根順利向根發育的重要機制之一。ECA、XTH是與植物根部細胞生長分裂時與細胞壁發育有關的基因，這2個基因表達水平的升高也證實了根系發育更加活躍，表明了二者參與了種子萌發、植株發育過程，在根系建成與緩解脅迫中發揮重要的作用［29-30］。此外，最新研究表明，RAE與CBS聯合使用可以促進作物的生長，提高生物量，并且相對于單獨使用RAE或CBS的效果更好［31］，再次證實二者在聯合使用時將發揮更好的作用。

工業生產維生素C所產生的液體廢棄物RAE和CBS均能促進鹽堿性土壤中棉花種子的萌發和根系發育，且兩者聯合使用效果更佳。一方面，通過改善土壤理化性質，增加土壤有機碳含量，降低土壤pH值，促進棉花種子萌發。另一方面，增強GLO基因的表達，提高根部維生素C的合成，提高種子萌發階段的鹽堿脅迫抗性，促進根的發育。本研究為RAE和CBS的資源化利用提供了重要理論依據，同時為我國鹽堿土棉花種植提供了一項簡便易行的提高種子萌發率的新技術。

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收稿日期：2022-12-07

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2020YFA0907800）；沈陽市科技計劃項目（編號：22-322-3-05）。

作者簡介：韓 曉（1998—），女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向為營養代謝與非生物脅迫。E-mail：hanxiao52002591@163.com。

通信作者：徐 慧，博士，研究員，博士生導師，研究方向為植物營養調節與環境微生物。E-mail：xuhui@iae.ac.cn。