基于網絡藥理學和分子對接技術川牛膝治療高血壓機制研究*

吳丹，胡建平，甘椿椿

1 衢州職業技術學院醫學院 浙江衢州 324000

2 黑龍江中醫藥大學 黑龍江哈爾濱 150006

3 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室 黑龍江哈爾濱 150006

4 黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室 黑龍江哈爾濱 150006

高血壓是一種常見的慢性病，也是導致心腦血管疾病最主要的危險因素，多發于中老年人、肥胖者與長期飲酒人群[1-2]。高血壓是指以體循環動脈血壓（收縮壓和、或舒張壓）增高（收縮壓≥140 mmHg （18.6 kPa），舒張壓≥90mmHg （12 kPa））為主要特征，同時可伴有腦、心、腎等器官的功能或器質性損害的臨床綜合征[3-4]。歐洲高血壓學會和心臟病學會指出，利尿劑、β 受體阻斷劑、鈣拮抗劑、血管緊張素轉化酶抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑均可作為高血壓病治療的起始及維持用藥[5]。但也存在一定的安全隱患，例如氫氯噻嗪等利尿劑，可引起低鉀血癥，血脂、尿酸代謝異常[6]；β 受體阻滯劑如美托洛爾等，可引起竇性心動過緩、支氣管哮喘等禁忌[7]；鈣拮抗劑如硝苯地平等，可引起心率增快、下肢水腫等[8]。

中藥治療高血壓類疾病具有多成分、多靶點、多層次、療效穩固和安全性高等特點，相對于單用西藥有著較明顯的優勢，尤其是在癥狀改善方面效果更為突出[9-10]。川牛膝是國家衛計委公布的可用于保健食品的一味中藥，具有逐瘀通經，通利關節，利尿通淋之功，不僅在多味中藥配伍治療高血壓疾病方面使用頻率較高，單用川牛膝也同樣具有良好的降壓效果，而且在肝氣上逆型高血壓的治療中，也同樣取得了較為滿意療效，其降壓機制與活血化瘀、引血下行的功效密切相關[11-13]。川牛膝雖然降壓效果明顯，但是仍缺乏大量的隨機樣本實驗，其降壓作用機制仍有待闡釋，同時關于川牛膝降壓的具體有效成分還有待進一步的確認。網絡藥理學是醫學、生物學、生物信息學等多學科基礎理論與研究手段的整合，能系統、科學、綜合地反映藥物對疾病網絡的干預機制。本文擬基于網絡藥理學和分子對接技術探討川牛膝治療高血壓的物質基礎與分子機制，借助網絡藥理學技術揭示川牛膝的主要有效成分以及治療高血壓疾病的潛在靶點和作用機制（見圖1），為川牛膝的臨床應用和深度開發提供研究基礎，也為發現藥物靶標、指導中藥研發和發展中醫藥理論提供一定的科學依據。

圖1 基于網絡藥理學和分子對接技術的川牛膝治療高血壓作用機制研究流程

資料與方法

1 川牛膝活性成分及相關靶點篩選

通過查閱Pubmed 上已發表相關文獻結合中醫藥系統藥理學平臺TCMSP 確定中藥川牛膝的組成成分，根據藥物代謝動力學屬性值口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥ 0.18 篩選活性成分[14]。根據每個活性成分可獲得的對應靶點蛋白，通過UniProt 數據庫（https：// www.uniprot.org）統一將化合物作用的蛋白質靶點進行信息規范轉換。

2 高血壓疾病相關靶點篩選

以“Hypertension”為關鍵詞，通過在線數據庫GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（http：//www.omim.org）挖掘與高血壓治療的潛在靶點，再進入DurgBank 數據庫（https：//www.DurgBank.ca）尋找治療高血壓疾病的臨床西藥作用靶點進行補充[15]。合并3 個疾病數據庫靶點后，刪除重復值得到整合后的高血壓疾病靶點蛋白。

3 川牛膝成分-高血壓疾病靶點PPI 網絡構建

為分析中藥川牛膝相關靶點與高血壓疾病靶點間的相互作用，將二者靶點基因取交集并繪制韋恩圖。將交集共同靶點提交至String 數據庫 （version 11.0，https：//string-db.org） 構建蛋白互作（PPI）網絡[16]。生物種類為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值“Highest confidence” 設置為（＞ 0.9）得到 PPI 網絡，通過 CytoScape 3.7.2 中插件MCODE 對蛋白互作網絡進一步分析，獲得潛在的蛋白質功能模塊，并通過分析其參與的生物學進程對其功能進行描述。運用Cytohubba 插件通過MCC 算法提取出前十關鍵基因并構建關鍵子網絡。

4 川牛膝成分-高血壓疾病靶點功能與通路的富集分析

Metascape 數 據 庫（http：//metascape.org/gp/index.html）擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數據資料[17]。將川牛膝治療高血壓相關靶點輸入Metascape 平臺，分析并富集其主要的生物學過程與代謝通路。

5 川牛膝成分-高血壓疾病靶點-通路網絡圖的構建

運用CytoScape 3.7.2 構建川牛膝成分-高血壓靶點-通路網絡圖。利用CytoScape 3.7.2 內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度（Degree）、緊密度（Closenesss）及介度（Betweenness）等，并根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

6 分子對接驗證

分析得到川牛膝活性成分-高血壓靶點網絡圖中度值排名前4 的核心靶點，查找其PDB ID，使用在線工具（CB-Dock Web Site）將4 個靶點與活性成分進行分子對接[17]，根據Docking Score 值評價靶點與活性化合物的結合強度與活性。

結 果

1 川牛膝活性成分靶點的獲取

根據藥物代謝動力學屬性值屬性值口服利用度（%）和類藥性篩選到川牛膝主要活性成分4 個，分別是β 艾蒿素、紅莧甾酮、β-谷甾醇和槲皮素，見表1。上述所有成分作用靶點共103 個，合并后刪除重復值共得到靶點88 個。

表1 川牛膝主要的降血壓活性成分

2 高血壓疾病相關靶點的獲取

分別從GeneCards、OMIM、DurgBank 數據庫中挖掘治療高血壓潛在靶點8435 個、67 個和312 個，整合上述3 個疾病數據庫靶點并刪除重復值，共得到8476個高血壓相關靶點。取活性成分靶點與疾病靶點基因交集并繪制韋恩圖（見圖2），對81 個交集靶點進行Uniprot 規范（見表2）。

表2 川牛膝活性成分與高血壓疾病交集靶點基因

圖2 川牛膝活性成分與高血壓疾病靶點基因交集

3 川牛膝成分-高血壓疾病靶點PPI 網絡的構建

將交集靶點基因提交至 STRING 11.0 平臺分析，將得到的數據通過Cytoscape 可視化分析得到靶點PPI 網絡（見圖3）。

圖3 川牛膝活性成分與高血壓疾病差異基因蛋白互作網絡

PPI 網絡中蛋白的作用是相互的。PPI 復雜網絡中存在部分密度較高的區域稱為 Community 或 Module，Module 網絡是PPI 網絡的潛在子網，其在區域部分連線少，連線密度較高，因此 Module 被認為是具有生物學意義的集合，該集合有2 種含義，一為蛋白質復合體，即多個蛋白質共同組成復合體而后發揮生物學作用；二為功能模塊，如位于同一通路的蛋白質，其相互作用更加密切。為更精確地分析川牛膝治療血脂異常的作用機制，運用 Cytoscape3.7.2 中的MCODE插件，通過分子復合物檢測算法對相互作用關系進行分析，得到 Module（圖4）。根據P 值，分別保留Module 中最佳評分的生物學進程對其進行功能描述（見表3）。并且運用Cytohubba 插件的MCC 算法提取出前十關鍵基因（見表4），構建關鍵子網絡進行觀察（見圖5）。

表3 川牛膝與高血壓疾病差異靶點PPI 提取模塊功能描述

表4 采用Cytohubba 插件MCC 算法提取的Hub 前十靶點基因

圖4 MCODE 提取川牛膝成分-高血壓疾病靶點PPI 網絡中的MCODE 得分

圖5 使用Cytohubba 插件提取的Hub 前十靶點關鍵子網絡

4 靶點功能與通路的富集分析

運用Metascape 平臺對川牛膝治療高血壓進行功能與通路分析，由結果可見多個靶點的功能與高血壓的調治關系密切，川牛膝治療高血壓主要參與的生物學過程見圖6 A，包括細胞對激素刺激的反應（Cellular response to hormone stimulus）、細胞對有機環狀化合物的反應（Cellular response to organic cyclic compound）、對類固醇激素的反應（Response to steroid hormone）、對有毒物質的反應（Response to toxic substance）、對異源生物刺激的反應（Response to xenobiotic stimulus）等，參與的通路見圖6D，主要有Pathways in cancer、Hepatitis B、Fluid shear stress and atherosclerosis 等，前十通路富集結果見表5，相關靶點調節高血壓的功能見圖6B，主要富集于轉錄因子結合（Transcription factor binding）、近端啟動子序列特異性DNA 結合（Proximal promoter sequence-specific DNA binding）等。

表5 川牛膝治療高血壓靶點top10 通路富集結果

圖6 潛在靶點的GO 富集分析

5 川牛膝成分-高血壓疾病靶點-通路網絡圖的構建

運用CytoScape 3.7.2 川牛膝成分-高血壓疾病靶點-通路網絡圖，見圖7。利用內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，分析結果表明槲皮素連接度為70，介度為 0.66097，緊密度為0.70833。其次為β-谷甾醇（連接度為16，介度為0.10679，緊密度為0.40157）、β 艾蒿素（連接度為7，介度為0.00807，緊密度為0.35172）以及紅莧甾酮（連接度為1，介度為0，緊密度為1.00000），見表6。預測槲皮素為川牛膝治療高血壓的核心活性成分。

表6 川牛膝主要活性成分網絡節點特征參數

表7 根據Degree 值排名前十的關鍵基因

圖7 川牛膝成分-高血壓疾病與成分差異基因- 通路互作網絡

6 分子對接驗證

CB-Dock 在線工具對接是一種蛋白質-配體對接方法，可自動識別結合位點，計算中心和大小，根據查詢配體自定義對接盒大小，然后與AutoDock Vina進行分子對接；CB-Dock 通過使用基于曲率的空腔檢測方法預測目標蛋白的結合位點和使用AutoDock Vina 來查詢配體的結合姿勢，可以促進對接過程并提高準確性。Docking Score＞4.25 時表示活性成分與靶點間存在結合能力，＞5.0 時表示結合活性較佳，＞7.0 時表示結合活性極佳[17]。分子對接所得結果顯示活性成分與靶點蛋白對接全部Docking Score ≥ 7（100%），最低為7.2，最高為9，說明川牛膝治療高血壓的四種活性成分β 艾蒿素、紅莧甾酮、β-谷甾醇和槲皮素與 4 個靶點的結合活性較強。評分與分子對接結果分別見表8 和圖8。

表8 川牛膝降血壓活性成分與靶點蛋白的對接評分

討 論

高血壓是一種常見的、同時伴隨著心腦血管病等發生的危險慢性疾病。中醫辨證角度認為，肝陽上亢、肝腎陰虛、陰虛陽亢是高血壓病的主要證候，在中醫臨床中多采用平肝潛陽、滋陰降火、祛痰化濕等治療方法[20-21]。目前關于中醫藥治療高壓病的研究較多，中藥降壓不僅不良反應小，價格低廉，而且具有多成分、多靶點和多層次的作用特點。尋求有效的中醫藥治療途徑，對發揮中醫藥的整體調節優勢有著十分重要的意義。川牛膝在多味用于治療高血壓疾病的中藥中，如通過與其他中藥進行配伍用于治療高血壓的一些常見證，如氣虛、陰虛、肝風癥以及陽亢癥等使用的頻率非常高且效果較好。故在中醫臨床上主要以川牛膝作為君藥，根據患者的癥狀進行增減，用以改善患者的血流平衡、調整氣血，進而對高血壓進行治療[22]。

本研究通過分子對接和網絡分析構建復合目標網絡。預測了川牛膝作為治療高血壓疾病活性成分出化合物為β 艾蒿素、紅莧甾酮、β-谷甾醇和槲皮素，其中槲皮素為川牛膝降壓的核心活性成分，闡明了川牛膝通過調節EGFR、ESR1、FOS、CCND1 等核心靶點干預高血壓疾病的相互關系。有研究表明表皮生長因子受體（EGFR）參與原發性高血壓[23]、肺動脈高壓[24]的調節；雌激素受體（ESR1）與妊娠高血壓密切聯系[25]，在心血管疾病中起著重要的生理作用；核蛋白轉錄因子（FOS）參與高血壓的調節，持續性高血壓會誘導FOS 蛋白的表達增高[26]，而鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶可通過降低FOS 蛋白的表達來減弱高血壓；細胞周期蛋白（CCND1）被證明參與了肺動脈高壓的發病機制[27]，對抗CCND1 可以改善大鼠的肺血管重塑，說明其可能是治療肺血管重塑和肺動脈高壓的潛在靶點[28]，由以上可知篩選出的核心靶點基因與高血壓疾病均具有一定的關聯性。

KEGG 與GO 分析川牛膝治療高血壓的生物學通路主要集中于流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路和糖尿病并發癥晚期糖基化終末產物及其受體信號通路等，其功能主要為通過質膜細胞粘附分子進行的嗜異性細胞間粘附等[29，30]。分子對接結果顯示川牛膝的降血壓活性成分與靶點的結合能力很強，分子對接評分均不小于7。基于生物信息學分析和計算機模擬技術，我們分析了川牛膝對高血壓的活性物質和可能的分子機制，為后續實驗研究提供了重要的理論基礎。然而，本次網絡藥理學研究中的分子對接結果僅提供了化學物質與相應靶基因之間的不確定聯系，與靶基因之間的精確作用模式如激活或抑制仍需要深入探討。后續，應對篩選后的潛在有效化合物進行實驗驗證，以深入闡明基于理論預測的藥物與蛋白質之間的相互作用。