基于網絡藥理學初探桃紅四物湯治療股骨頭壞死機制及實驗驗證*

榮尚，吳智恒，馬文元，吳睿哲，吳潔，孫紹裘

1 湖南中醫藥大學 湖南長沙 410208

2 湖南中醫藥大學第二附屬醫院 湖南長沙 410005

股骨頭壞死是因各種原因引起的股骨頭血供的中斷或者破壞，從而引起股骨頭里面骨細胞和骨髓成分的破壞、死亡的一種常見骨科疾病。學者們提出了的一些潛在機制有骨細胞凋亡、細胞分化紊亂、血管生成障礙等[1]。美國，每年約有2 萬至3 萬名患者被診斷。目前各種治療方法中，核心減壓是治療塌陷前股骨頭壞死最常用的治療方法，可緩解骨病早期的疼痛[2]。在中國已大約有800 萬人患有股骨頭壞死，約有10%的創傷性患者需要進行人工全髖關節置換手術，造成嚴重的經濟和社會負擔。中醫藥治療具有不良反應小、小創傷、可以有效緩解患者癥狀等優點，成為現在臨床一線首選方案[3]。

現有大量文獻和實驗表明桃紅四物湯可通過誘導局部血管新生及新骨生成從而促進骨損傷的修復與重建，涉及TGF-β、MAPK、Notch 等多條信號通路[4]。TGF-β 下游分子骨形態發生蛋白相關的BMP/Smad 是一條重要的誘導成骨形成的信號通路。但關于中醫藥在此信號通路相關研究文獻的報道較少。故通過BMP/Smad 信號通路探究桃紅四物湯對創傷性股骨頭缺血性壞死模型大鼠成骨相關因子的影響，揭示桃紅四物湯對本病的療效機制，為防治股骨頭壞死提供新的治療策略。桃紅四物湯這一經典名方最早見于清代的《醫宗金鑒》，該方開始的用途是用來治療血瘀所致的月經先期及骨關節炎[5]。相關研究已經證明，桃紅四物湯可有效抑制膝關節骨性關節炎大鼠關節軟骨中基質金屬蛋白酶的表達，并降低局部組織中白細胞介素的水平，減輕關節炎癥[6]。中醫藥治療疾病的特點是揣外之內、見微知著。結合骨傷科特點，進行先辨病再局部辨證，最后通過靈活藥物的搭配，從整體疾病的角度出發，實現對機體紊亂的調節[7-8]。我們嘗試通過對GO 富集分析及KEGG 通路的分析和細胞實驗，進一步研究THSWD 治療股骨頭壞死的潛在機制，并進行初步的實驗驗證。為研發THSWD 的有效成分和提供更廣的應用。

資料與方法

1 數據來源

本項研究中所使用的網絡數據庫及應用軟件如下：囊括了藥物、靶標和疾病之間的關系的中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、人類基因數據庫（GeneCards）、在線人類孟德爾遺傳數據系統（OMIM）、STRING 平臺、Cytoscape 軟件、Python3.6 編程軟件、Jamovi 2.3.13 統計軟件。

2 桃紅四物湯有效成分庫及靶基因庫構建

登錄TCMSP 數據庫，分別以“桃仁”“紅花”“熟地黃”“當歸”“芍藥”“川芎”檢索藥物所含的有效成分，并進行初步篩選。進入人體的藥物要經過吸收、分布、代謝和排泄等過程才能到達靶器官發揮藥效作用，DL、OB 是中藥有效的活性成分參與ADME 過程的關鍵參數。條件為：OB（口服生物利用度是指一種藥物在攝入后進入體內循環的量）＞30%，生物類藥性（DL）＞0.18，獲取符合條件的活性成分。并通過Python 編程軟件構建靶基因庫。

3 股骨頭壞死靶基因庫

構建以“Osteonecrosis of the Femoral Head”為關鍵詞的基因數據庫。以“Osteonecrosis of the Femoral Head”為關鍵詞分別在 GeneCards 數據庫、 OMIM 數據庫檢索疾病基因。刪除重復性，合并所查得的有關股骨頭壞死的靶基因，篩選并構造股骨頭壞死疾病對應的靶基因庫。

4 交集基因庫構建

使用 Python 編程軟件，獲得桃紅四物湯有效成分治療的靶基因與股骨頭壞死對應的靶基因的交集基因，并繪制 Veen 圖，篩查出共同靶點基因。

5 藥物成分-靶基因-疾病調控網絡的構建

利用Cytoscape 軟件對 STRING 網站物種設置為“Homo sapiens 得到的結果與桃紅四物湯有效成分以及共同靶點基因進行分析，構建藥物成分-靶基因-疾病調控網絡，以介數和自由度的均值作為截點，將截點之上的靶點作為關鍵靶點，并分析其藥理作用。

6 GO 功能富集分析與 KEGG 通路富集分析

將所得到的桃紅四物湯-股骨頭壞死共同靶點基因進行整理格式，通過David 分析平臺進行GO 、KEGG 分析。David 數據庫是一個基因功能注釋分析工具，可以實現基因功能注釋，并進行基因相關的蛋白質網絡分析。

7 細胞試驗

7.1 CCK8 檢測 將大鼠BMSC 細胞培養于含10%FBS+1% 雙 抗 的DMEM/F-12 中 培 養。分3 個組處理，分別為BMSC 組、BMSC+15% 桃紅四物湯血清組、BMSC+BMP 抑制劑UK383367 組。加入含有CCK8 的培養基，孵育后于Bio-Tek 酶標儀分析450nm 處吸光度（OD）值，來測定細胞活力。

7.2 Western Blot 將BMP-2（美國proteintech 公司提供抗體）、BMP-4（博奧森公司提供抗體）、Smad1（美國proteintech 公司提供抗體）、Smad5（博奧森公司提供抗體）、Smad8 （博奧森公司提供抗體）、Runx2（博奧森公司提供抗體）、Osterix（英國abcam 公司提供抗體）、β-actin（美國proteintech 公司提供抗體）等在細胞中的表達蛋白提取后，按照BCA 蛋白定量試劑盒說明書的規范操作，測定蛋白濃度。將樣品準備好后，進行轉膜及封閉。最后顯色曝光。

結 果

1 桃紅四物湯有效成分庫及靶基因庫

篩選標準為：OB 值≥30%，DL 值≥0.18；檢索TCMSP 數據庫后共得到62 個有效成分，196 個對應靶點。為了證實THSWD 對股骨頭壞死具有良好的治療作用，我們利用不同的數據庫收集了862 個不同的股骨頭壞死靶基因和196 個THSWD 靶基因。通過對它們的交叉點，我們得到了65 個共同的靶基因，見表1，圖1。

圖1 韋恩圖

圖2 靶點基因網絡

表1 桃紅四物湯有效成分

2 網絡構建與分析

圖中節點為靶點及化合物，Degree 值越大則節點越大、顏色越深，表示該節點與其他節點之間的關系越緊密，結合相關文獻，得出桃紅四物湯治療股骨頭壞死的核心靶點為PTGS2 、PTGS1、TNFRSF1A、VEGFA 等。蛋白質基因之間的相互作用來自已經證實研究的系統數據庫。蛋白質共同工作，以促進共享的功能；利用 Cytoscape3.8.軟件建立活性成分與靶點相互作用網絡，如圖3，共有91個節點和181 條邊。根據Cytoscape 網絡圖，核心有效化合物為MOL000098 槲皮素、MOL000006 木犀草素、MOL002714 黃芩素、MOL000422 山奈酚、MOL002773β-胡蘿卜素。

圖3 KEGG 通路富集

3 GO 富集與 KEGG 信號通路富集

疾病的發生和藥物的治療是多個尺度上相互作用的動態過程，包括DNA 損傷、基因突變、細胞周期行為、種群動態、炎癥、代謝-免疫平衡。為了探討THSWD 對股骨頭壞死的動態演變過程。通過微生信平臺進行了GO 與 KEGG 信號通路富集分析如圖4-7。以P＜0.05 作為篩選條件，篩選出前 20 位的基因本體和前 30 位 KEGG 通路，p 值越小、柱狀圖顏色越紅說明富集程度越顯著。KEGG 富集分析得到131 條通路，其中有 105 條信號通路 P-Value＜0.01，對 P 值及富集顯著的前 30 條信號通路進行分析如圖所示，結果表明富集顯著的信號通路主要有MAPK 信號通路、HIF-1 信號通路、NF-κB 信號通路、IL-17信號通路、TNF 信號通路、糖尿病并發癥中的AGERAGE 信號通路等。GO 注釋結果顯示桃紅四物湯的65 個關鍵靶點富集顯著的前10 個生物學功能：凋亡過程、凋亡過程的負調控、細胞增殖的正調控、基因表達的正調控、炎癥反應、對外來刺激的反應、血管生成、凋亡過程的正調控、對藥物的反應、缺氧反應；位于前10 的細胞組分：細胞質、質膜、外泌體 、 細胞內膜細胞器、線粒體、細胞胞外區、細胞表面、 高分子復合物、粘著斑、細胞外間隙 ；位于前10 的分子功能：蛋白質結合、相同蛋白結合、轉錄因子活性，序列特異性DNA 結合、高分子復合物結合、蛋白質同二聚體活性、生長因子活性、絲氨酸型內肽酶活性、酶結合、內肽酶活性、血紅素結合。綜上提示THSWD 可通過調控多個生物過程治療股骨頭壞死。

圖4 生物學功能GO 富集圖3 KEGG 通路富集

圖5 細胞組分GO 富集

圖6 分子功能GO 富集

4 細胞驗證實驗

4.1 細胞增殖率 大鼠BMSC 細胞活力在培養24h時（見圖7、圖10），且差異與其他2 組具有統計學意義。說明桃紅四物湯對BMSC 細胞增殖抑制率隨培養時間延長呈逐漸升高趨勢。

圖7 細胞增殖率

圖8 western blot 蛋白表達

圖9 各蛋白灰度分析

圖10 CCK8 檢測

4.2 蛋白的相對表達量 BMP-2，BMP-4，Smad1，Smad5， Smad8，Runx2，Osterix 在BMSC+15%桃紅四物湯血清組中的表達量均高于BMSC 組、BMSC+BMP抑制劑UK383367 組，提示桃紅四物湯可促進以上蛋白的表達，將曝光后的底片掃描，并用quantity one 專業灰度分析軟件進行分析。并用jamovi 2.3.13 軟件進行繪圖（見圖8、圖9）。給藥 48 h 后，隨著藥物濃度增加，與空白組及對照組相比，桃紅四物湯組均顯著 升 高 了BMP-2、BMP-4、Smad1、Smad5、Smad8 、Runx2、Osterix 蛋白水平，差異具有統計學意義（P＜0.05）。提示桃紅四物湯對BMSC 的增殖作用可能與上調上述蛋白水平有關。

總 結

股骨頭壞死是一種常見的骨科疾病，治療難度大，發病率高。股骨頭壞死病因復雜且危害嚴重，目前尚無特效藥物。如果沒有完全治愈的方法，對于年輕患者，特別是青少年，手術干預保留髖關節更合適[9]。股骨頭壞死是一種進行性發展的骨科疾病，因此，減緩或逆轉其病變進展是至關重要的。《素問·宣明五氣》云：“血氣不和，則變生百病。 ”中醫治療骨痹早期以活血化瘀為主[10]。 桃紅四物湯作為活血化瘀的經典方劑，歷來被認為是治療骨痹的代表方。在這一方面，桃紅四物湯治療骨傷科疾病的作用越來越受到重視。桃紅四物湯是治療血瘀疾病的千古名方，但治療股骨頭壞死的作用機制尚不明確。

我們嘗試運用構建“成分-疾病-靶點”中藥復方調控網絡，根據初步篩選得到62 個有效化合物，65個靶點，根據cytoscape 互作網絡圖得出桃紅四物湯防治股骨頭壞死的有效成分為槲皮素、木犀草素、黃芩素、山奈酚、β-胡蘿卜素。并且其中多數化合物歸屬于桃仁、紅花此兩味藥材，這與臨床上中醫藥治療股骨頭壞死的用藥頻率一致，體現了活血化瘀的特點。

此外，拓撲分析發現PTGS2、PTGS1、TNFRSF1A、VEGFA 等是關鍵靶點。前列腺素內過氧化物合酶（Prostaglandin-Endoperoxide Synthases ，PTGS），又稱環加氧酶。 PTGS 有兩種同工酶：組成型PTGS1 和誘導型PTGS2。PTGS 與炎癥和有絲分裂發生相關的前列腺素生物合成有關[11]。是幾種炎性前列腺素合成過程中催化限速步驟的關鍵酶，是重要的炎癥相關靶點，羅銘然等研究證實 PTGS2 、PTGS1 通過抑制下游炎癥通路從而對 MC3T3-E1 細胞成骨分化起重要的調控作用[12]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是哺乳動物免疫反應的關鍵介質和調節器。TNF 控制免疫系統的發育、細胞存活信號通路、增殖和調節代謝過程[13]。TNF-α 通過作為三聚體結合到55 kDa 細胞膜受體TNFR-1 或75 kDa 的細胞膜受體TNFR-2 發揮許多作用。TNF 誘導的信號轉導途徑通過參與所有TNF 依賴性膜相關和細胞內蛋白信號復合物的分子泛素化和磷酸化受到嚴格調控[14]。血管內皮生長因子（VEGF）是一種與血管和淋巴管生成密切相關的相關因子[15]。特別是VEGFR2 具有較強的酪氨酸激酶活性；VEGFR1 可刺激各種組織中炎癥反應，并通過促血管生成、腫瘤轉移、淋巴管生成、關節炎和動脈粥樣硬化促進多種疾病的發生發展[15]。VEGF 系統對于骨髓修復重建和傷口愈合等方面也扮演著至關重要的角色[16-17]。

GO 功能注釋及 KEGG 通路富集結果表明，篩選所得關鍵靶點主要涉及免疫反應、氧化應激反應、炎癥反應、信號轉導等一系列生物學反應過程。結合相關文獻，推測桃紅四物湯治療股骨頭壞死的信號通路為MAPK 信號通路、HIF-1 信號通路、NF-κB 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路。

在嚴重缺氧時，缺氧誘導因子（HIF-1）被激活，作為轉錄因子，調節機體的代謝和功能，以適應缺氧情況[18]。有研究表明，缺氧通過激活HIF-1-EPO 通路導致EPO 水平升高，EPO 會上調EPO 通過促進有絲分裂來促進EPC 和ST2 的增殖，而不影響細胞凋亡。血管生成和成骨相關因子的蛋白和mRNA 水平表達量升高。從而促進骨缺損模型的新骨形成[19]。

NF-κB 是一種調節骨形成炎癥反應和骨重塑過程的轉錄因子。NF-κB 家族可以選擇性的結合在B細胞κ-輕鏈增強子上調控[20]。NF-κB 信號通路的關鍵靶點是IL-1R、TNF-R1、TLR4、RANK，主要參與炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等過程[21]。相關證據表明，NF-κB 通過同時調節炎癥和骨重塑過程，是炎癥相關骨疾病的重要潛在治療靶點[22]。近年來，具有不同方法調節NF-κB 活性的新型抑制劑，以及控制釋放或骨靶向藥物傳遞策略的發展，極大地增加了NF-κB 治療在骨疾病中的應用[23]。

白細胞介素（IL-17）是觸發炎性骨丟失的重要促炎細胞因子。IL-17 細胞因子家族由6 個成員組成，IL-17A 到IL-17F，主要由T 輔助細胞17（Th17）細胞分泌[24]。IL-17A 誘導TNF、IL-1β、IL-6、CXCL1、CXCL8、CXCL10、MMPs 的表達。IL-17A 在調節骨重塑中發揮重要作用。病理性骨吸收是由破骨細胞分化和/或活性增加引起的。IL-17 通過協調破骨細胞的分化和激活，對維持骨量至關重要[25]。IL-17 通過激活核因子κ-B 的RANKL 受體激活因子-骨保護素系統來誘導破骨細胞的形成[26]。IL-17 還通過誘導IL-1 和TNF-α 的表達間接促進破骨細胞的形成，并與TNF-α 協同參與破骨細胞分化和骨吸收[27]。

TNF-α 是骨重塑的調節因子，它是病理性骨丟失的核心作用，因為它降低成骨細胞的活性和存活，增加破骨細胞的分化、招募和活性[28]。TNF-α 在骨中的所有功能都依賴于TNFR1。TNF-α 是一個大型細胞因子家族的原型，它作為三聚體與跨膜受體結合，激活各種細胞信號通路[29]。TNF-α 也是急性或慢性炎癥以及宿主對病原體的防御的主要調節因子。TNF-α 對體外成骨形成的明顯作用是通過抑制骨形成必不可少的兩種轉錄因子的表達： Runx2 及其下游靶點Osterix 的表達來阻斷成骨細胞分化[30]。在分子水平上，TNF-α 在多個水平上阻斷Runx2 的表達。它抑制runx2 的轉錄，使其信使不穩定，并通過上調E3 泛素連接酶Smurf1 和Smurf2 來促進runx2 蛋白的降解。此外，TNF-α 還可以刺激NF-κB 激活，抑制TGF-β/bmp 誘導的成骨細胞Smad 信號通路，降低Runx2 的表達。

MAPK-細胞外信號調節激酶（ERK）通路是細胞表面和細胞核之間調節增殖和分化遷移以及細胞死亡的重要環節。此外，MAPK 通路在骨形成中起著關鍵作用，因為它可以與所有的分子通路進行串聯[31]。在另一項研究中，系統分析使用基因微陣列分析和生物信息學分析表明，MAPK 信號通路激活氧化鐵納米顆粒治療人類骨源性間充質干細胞，促進成骨分化[32]。

如 下 圖12 所 示，TGFB 為MAPK 信 號 通 路 中的重要組成部分，是關鍵節點之一。轉化生長因子β（TGF-β）/骨形態發生蛋白（BMP）信號傳導參與絕大多數細胞過程，在整個生命過程中至關重要[33]。TGF-β/BMP 在哺乳動物發育過程中的骨形成中具有廣泛的作用，并在體內發揮著多種調節功能。TGF-β/BMPs 的信號轉導具體通過經典Smad 依賴途徑和非經典Smad 獨立信號途徑（p38 絲裂原活化蛋白 激 酶 途 徑，MAPK）[34]。Runx2 和TGF-β/BMP 激活的Smad 的協同活性對骨骼的形成至關重要。BMP（骨形態發生蛋白）為TGF-β 超家族中的重要成員。BMP 通過調節一系列下游基因的活性，參與調控中胚層形成、神經系統分化、牙齒和骨骼發育以及癌癥發生等生物學過程。其中的BMP-2、4 均具有較強的成骨能力[35]。BMP 信號的傳遞主要通過配體BMP 與細胞膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體（BMP receptor，BMPR）特異性結合，形成配體受體二元復合物[36]。與此同時BMPR2 能夠活化BMPR1，并將信號傳送給細胞內的Smad 分子[37]。骨骼的形成也依賴于Runx2和BMP/TGF-β 激活的Smads 的協同活性。TGF-β/BMP2 信號通路、MAPK 依賴的磷酸化和Runx2 亞核靶向匯聚起來可誘導成骨表型[38]。Osterix 是一種屬于特異性蛋白（Sp）家族在2002 年被發現的鋅指轉錄因子。迄今為止，大量研究確定了Osx 在骨形成中的重要作用。如果成骨細胞特異性標記基因不能在Osx突變胚胎中表達，則不能形成骨[39-40]。綜上故選取相關蛋白，作為桃紅四物湯治療股骨頭壞死的實驗驗證。并在相關實驗中，提示桃紅四物湯有抗炎、促成骨分化，骨形成的相關作用。進一步為臨床應用提供了實驗驗證證據。

圖12 MAPK KEGG PATHWAY

結 論

本研究通過網絡藥理學，組建交互網絡。結果表明，桃紅四物湯具有多靶點治療股骨頭壞死的特性。此外，桃紅四物湯對除股骨頭壞死以外的疾病，如血脂異常、肝炎、腫瘤等還具有潛在的治療潛力。這說明不同的疾病可以用相同的中藥處方來治療，符合了中醫藥的特點“異病同治”。綜上，體現了中藥復方中含有多靶點、藥理作用廣泛的特點[41-43]。本研究通過系統網絡藥理學初步確定了桃紅四物湯的促進血液循環、抗炎、促進骨修復的作用。未來將補充分子對接，進一步闡釋相關有效成分與相關靶點關系。本研究建立的藥物-靶點-疾病網絡，為臨床治療股骨頭壞死提供了臨床依據。